Аналіз in vitro

Для багатьох досліджень, які неможливі для досліджуваних, процедури тестування in vitro стають все більш важливими.

Для косметичних продуктів, які часто використовуються протягом тривалого періоду часу, дерматологічне тестування на безпеку є важливою передумовою високого рівня безпеки застосування та задоволеності споживачів. Визначаючи та оцінюючи надійні та відтворювані біологічні кінцеві точки на основі гістологічних та біохімічних аналізів, можна зробити твердження про вплив продукту на регенеративні біологічні процеси шкіри.

3D-модель шкіри особливо підходить для такого обстеження, оскільки вона формує природну гістологічну послідовність шарів епідермальних клітин та шкірних структур, як відомо з епідермісу людини. Базальний шар, базальний шар кератиноцитів, лежить безпосередньо на еквіваленті живої дерми (фібробласти), а за ним гістологічно слідують spinosum spinosum і stratum granulosum, які остаточно покриваються роговими клітинними шарами рогового шару.
Порушення регулярної епідермальної ороговіння (ортокератоз), спричинені різними подразниками фізичного (механічного, УФ-А/В) або хімічного (СЛС) характеру, можна аналізувати та оцінювати кількісно та якісно.

У дослідженнях in vitro ми досліджуємо:

  • Цілісність шкірного бар'єру/регенерація після пошкодження,
  • Пошкодження UVA/B,
  • Сумісність продукту.

  • епідермальна диференціація,
  • Шкірний бар'єр відповідних структур,
  • життєздатність,
  • Цілісність дермо-епідермальної зони (DEJ),

  • Морфолого-гістологічні структури після спеціального фарбування,
  • Імунофлуоресцентне фарбування білків, що беруть участь у диференціації корнеоцитів,
  • Кількісне визначення інтерлейкінів (наприклад, IL-1α, Il-6) за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА),
  • інші методи в розробці.

Гістологічний аналіз

Гістологія - це наука про біологічні тканини (histos = тканина & logos = навчання). За допомогою гістології тканинно-морфологічні зміни на клітинному рівні можна зробити видимими за допомогою специфічного фарбування та оцінити відповідно. Найбільш поширеним фарбуванням, що застосовується в гістології та гістопатології, є фарбування H&E. Тут нуклеїнові кислоти забарвлені інтенсивно в темно-синій колір, цитоплазма та сполучна тканина рожево-червоні. На малюнку нижче показано H&E фарбування здорової моделі (A) та ультрафіолетової, пошкодженої моделі (B).

аналіз

Фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) ультратонкої ділянки A) необроблена модель B) модель, опромінена УФВ (250 мДж/см2) через 48 годин. закриті стрілки: спалені сонцем клітини; відкриті стрілки гідропічних клітин (масивне скупчення рідини). *: типовий дискератоз (розлад ороговіння) після дії УФ.

Модель демонструє всі фізіологічні шари (базальний шар, спинний, гранульозний та роговий) шкіри рідної людини, а також справжнє ороговіння (А). На малюнку B показана модель через 48 год після впливу УФ-випромінювання (250 мДж/см2).
Типові особливості сонячних опіків чітко впізнавані. Численні так звані "спалені сонцем клітини" (закрита стрілка), гідропічні клітини, які містять більше рідини і менш яскраво забарвлене ядро ​​(розкриті стрілки), а також типовий розлад ороговіння (дискератоз).
Крім того, видно поодинокі вакуолізовані кератиноцити. За допомогою цієї моделі захисну функцію (захист від сонця) та/або регенераційний потенціал препарату або окремих речовин можна дослідити та оцінити на клітинному рівні.

Аналіз швидкості поділу клітин

Швидкість ділення клітин (проліферація) є важливим показником життєздатності або “придатності” тканини. В епідермісі людини лише кератиноцити базального шару (базальні кератиноцити) здатні до поділу клітин. Вони компенсують втрачені корнеоцити внаслідок процесу постійного відшарування, забезпечуючи тим самим гомеостаз тканини та запобігаючи клітинному витонченню епідермісу.


Ультратонкий зріз повної моделі шкіри. A) зображення яскравого поля B) флуоресцентне зображення. Синій = клітинні ядра, червоний: діляться клітини.

За допомогою технології Click-It EdU® базальні кератиноцити епідермісу та фібробласти дерми можуть бути спеціально позначені (A + B) на моделі шкіри під час поділу клітин (мітоз). На основі цього можна визначити, чи впливає речовина або рецептура на поведінку клітинного поділу після певного місцевого або системного застосування та часу лікування.
Проведення необробленого контролю дозволяє кількісно визначити відсоток швидкості поділу клітин. Приклади підвищеної активності поділу клітин: загоєння ран, запальні процеси.

Цілісність шкірного бар’єру

Іншим важливим параметром для здорової шкіри є інтактний шкірний бар'єр, який, з одного боку, запобігає надмірній втраті води, а з іншого боку, є ефективним захисним захистом від патогенних мікроорганізмів, впливів навколишнього середовища та (хімічних) шкідливих речовин.


Ультратонкий зріз повної моделі шкіри. A) Лікування стерильним PBS B) 45-хвилинне лікування 1% SDS.
Синій = клітинні ядра, зелений: Люцифер жовте забарвлення.

Окремі речовини, цілі рецептури або хімічні нокси можуть впливати на цілісність шкірного бар’єру. Це може призвести до збільшення втрат води (збільшення випаровування) та поглинання шкідливих речовин із навколишнього середовища, які (пасивно) потрапляють у шкіру. У моделі на повній шкірі, показаний жовтий колір Люцифера можна використовувати для дослідження, чи впливає продукт на шкірний бар’єр. Стерильна вода або PBS (забуференний фосфатом сольовий розчин) не впливають на цілісність бар'єру (A). Місцево застосовуваний барвник повністю залишається у верхніх шарах шкіри (роговий шар).
Однак 45-хвилинне лікування поверхнево-активною речовиною SDS (1%) призводить до пошкодження шкірного бар'єру (B). Барвник проникає в глибокі шари шкіри (дерму). Цей метод також може бути використаний для дослідження того, чи може виріб відновити бар'єрну функцію після пошкодження.