Білірубін підвищує чутливість до інсуліну, регулюючи обмін холестерину, рівень крові
Теми
Ця стаття оновлена
Анотація
вступ
Ожиріння досягло масштабів епідемії у всьому світі, і щороку щонайменше 2,8 мільйона людей помирають від надмірної ваги або ожиріння (ВООЗ). Ожиріння також є найважливішим фактором ризику інсулінорезистентності, серцево-судинних захворювань та діабету 2 типу (T2DM) 1. Пацієнти з T2DM зазвичай гіперглікемічні та страждають такими ускладненнями, як гіпертонія, інсульт, атеросклероз та рак 2. Очікується, що стратегії зменшення ожиріння зменшать смертність та покращать якість життя постраждалих.
Ми показали, що системне введення білірубіну підвищує чутливість до інсуліну шляхом придушення стресу та екстреного запалення у мишей DIO 35. Зараз ми розширили ці спостереження та вивчили, чи регулював білірубін ліпідний обмін, як у пацієнтів із хворобою Гілберта 34, і чи регулював білірубін рівень адипокіну в сироватці крові у мишей DIO. Ми також оцінили довгострокові наслідки лікування білірубіном на обмін ліпідів та рівень адипокіну через 7 тижнів після припинення лікування білірубіном.
Результати
Введення білірубіну зменшує масу тіла та покращує резистентність до інсуліну у мишей DIO
Повний розмір таблиці
( в ) Вага печінки мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW. ( ) Вага епідидимального жиру у мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW. ( проти ) Фракції вакуольної зони в печінці мишей DIO + BR, DIO + V або CHOW. ( d ) Діаметри ліпідних бульбашок (мкм) епідидимальних адипоцитів DIO + BR, DIO + V або CHOW. ( e ) Репрезентативні мікрофотографії H&E фарбування зрізів печінки та жирової тканини мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW. Шкала шкали = 200 мкм. Щонайменше 3 миші аналізували в кожній групі; * стор
Рівні ТК у сироватці крові ( в ), ЛПНЩ ( ), ЛПВЩ ( проти ), TG ( d ), лептин ( e ), адипонектин ( f ), загальний білірубін ( g ) і прямий білірубін ( h ) у мишей DIO + BR, DIO + V або CHOW вимірювали в сироватці відразу після закінчення лікування білірубіном. Кожна група містила 3-4 миші; Дані є середнім значенням ± стандартне відхилення; *** стор
Відносна експресія мРНК рецептора інсуліну (Insr) ( в ), SREBP-1 ( ), Фасн ( проти ) та ACC ( d ) у печінці мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW, виміряні методом RT-PCR. Ці значення представляють відносну експресію цільового гена щодо експресії ендогенного контролю. ( e ) Експресія білків PPARγ та C/EBPa, визначена в печінці у мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW методом Вестерн-блот-аналізу. Гелі запускали в однакових експериментальних умовах, і показали зрізані плями. ( f ) Відносне вираження PPARγ та ( g ) C/EBPα порівняно з контролем гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) (програмне забезпечення NIH ImageJ). Аналізували зразки від 3 особин. Дані є середнім значенням ± стандартне відхилення; *** стор
( в ) Вага тіла мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW під час 9-тижневого експерименту. ( ) Рівень глюкози в сироватці крові у мишей DIO + BR, DIO + V та CHOW протягом 9-тижневого експерименту. Вага печінки ( проти ) та епідидимальний жир ( d ), виміряний через 7 тижнів після закінчення лікування. ( e ) (зліва) GTT мишей DIO, виміряний через 7 тижнів після закінчення лікування; (праворуч) значення площі під кривою над базовою лінією; ( f ) Миша ITT DIO (ліворуч) вимірюється через 7 тижнів після закінчення лікування; (праворуч) значення оберненої площі над кривою нижче базової лінії. Принаймні 3 миші були включені в кожну групу. Дані є середнім значенням ± стандартне відхилення; *** стор
Найдраматичнішим результатом цього дослідження було те, що лікування білірубіном знижувало загальний рівень холестерину у мишей DIO. Зменшення може бути зумовлене зміною рівня ЛПВЩ та ЛПНЩ, хоча скорочення цих елементів не досягло статистичної значущості. Ці результати узгоджуються з результатами, що спостерігаються у пацієнтів із синдромом Жильбера, у яких незначно підвищений рівень білірубіну пов'язаний зі зниженням концентрації загального холестерину, ЛПНЩ та тригліцеридів, а також зниженням статусу. 34, 37, 38, 39. Хоча ми не спостерігали жодної зміни концентрації тригліцеридів у мишей, які отримували білірубін через 14 днів після лікування, через 7 тижнів після лікування спостерігалося зниження, що вказує на те, що вплив білірубіну на рівень тригліцеридів може затримуватися. Наше дослідження показало, що екзогенно введений білірубін був пов'язаний зі зміною ліпідного профілю у мишей із ожирінням.
Ми виявили, що введення білірубіну значно знижувало рівень лептину у мишей DIO. Вживання їжі мишами DIO, які отримували білірубін, не було важливим фактором під час лікування білірубіном, і ніякої різниці в споживанні їжі не спостерігалося після припинення лікування. Зниження рівня лептину у мишей, які отримували білірубін, може бути спричинене зменшенням жирової тканини, а також зниженням експресії SREBP-1. Доречні ще два спостереження: відомо, що лептин посилює запалення, регулюючи TNF-α 40, і що лікування білірубіном зменшує експресію TNF-α у мишей DIO 35. Отже, розумно припустити, що вплив білірубіну на ожиріння є наслідком порушення синтезу ліпідів, зниження рівня лептину та зменшення продукції TNF-α. Клінічно білірубін слід розглядати як потенційне лікування зниження синтезу ліпідів, як пропонують дослідження на людях 34 .
У цьому дослідженні ми виявили, що короткочасне лікування білірубіном асоціювалося зі зниженням загального холестерину та збільшенням PPARγ та адипокінів. Ці результати дають механістичні докази того, що метаболізм білірубіну або змінений білірубін (наприклад, часткові інгібітори UGT1A1 49) може бути корисним як терапевтичний підхід для зменшення ожиріння та підвищення стійкості до нього.
Методи
Тварини
Самці мишей C57BL/6 (віком 6 тижнів) були придбані в Інституті генетики та біології розвитку Китайської академії наук (Пекін, Китай). Мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (таблиця 1) або стандартною дієтою CHOW-жирами (10% калорій з жиру) протягом 24 тижнів до лікування. Комітет з догляду за тваринами Циндаоського сільськогосподарського університету схвалив усі експерименти на тваринах. Методи застосовувались відповідно до затверджених керівних принципів.
Приготування та введення білірубіну
Білірубін (Frontier Scientific, Logan, UT) розчиняли в 0,1N NaOH і рН доводили до 7,4 за допомогою HCl. Білірубін вводили внутрішньочеревно по 20 мкмоль/кг (11,7 мг/кг) двічі на день протягом 14 днів. Контрольні миші DIO або CHOW отримували транспортний засіб за однаковим графіком введення.
Миша після лікування
Цукор крові та вагу тіла мишей, що не приймали натощак, вимірювали щодня о 9:00 ранку. Краплю цільної крові (приблизно 5-10 мкл) збирали з мінімального розрізу хвоста на кінці хвоста миші та аналізували за допомогою глюкометра Sannuo (San Nuo Inc., Чанша, Китай). Фізичні навантаження мишей (поведінка, споживання їжі, вживання алкоголю та облизування) спостерігали щодня, як описано 35. Споживання їжі (за винятком розливу) вимірювали протягом 24 годин через 7 днів після лікування та один раз на тиждень протягом 7 тижнів після лікування білірубіном.
Внутрішньочеревна толерантність до глюкози (IPGTT) та тест на толерантність до інсуліну (ITT)
Для IPGTT миші голодували протягом ночі, потім вводили 2 г/кг розчину глюкози (ip). Для ІТТ мишей голодували протягом 5 годин, потім вводили 0,75 ОД/кг інсуліну (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). Цукор у крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хвилин після ін’єкції глюкози або інсуліну.
Збір тканин, підготовка сироватки та біохімія крові
В кінці кожного експерименту мишам знеболювали і забирали кров ретроорбітальною кровотечею в гепаринізованій пробірці. Плазму отримували центрифугуванням і зберігали при -80 ° С для подальшого аналізу. Потім мишей евтаназували, а печінку та епідидимальні жирові тканини відокремлювали, зважували та заморожували в рідкому азоті для подальшого аналізу. Рівні КТ, ТГ, ЛПВЩ, ЛПНЩ та білірубіну в сироватці крові вимірювали за допомогою специфічних наборів реагентів (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Рівні лептину, інсуліну та адипонектину вимірювали методом ІФА (R & D Systems, Міннеаполіс, Міннесота).
Аналіз у реальному часі (RT) -PCR
Експресія рецептора інсуліну, рецептора лептину, аполіпопротеїну A-IV (Apoa4) та SREBP-1 у печінці визначалася кількісно за допомогою аналізу RT-PCR, як описано раніше 50. Експресію β-актину кількісно визначали за допомогою RT-PCR у кожному зразку та використовували як ендогенний контроль. Праймери RT-PCR у реальному часі були придбані у Life Technologies (Invitrogen Trading Co., Ltd., Шанхай, Китай).
Вестерн-блот-аналіз
Вміст білка в цільноклітинних лізатах визначали кількісно за допомогою аналізу BCA, і 30 мкг білка від кожного зразка поділяли на 4–12% гелі Bis-Tris (Інститут біотехнології Бейотіме, Хаймен, Китай). Білки переносили на мембрану Hybond-P (GE Healthcare, Piscataway, NJ), блокували 5% знежиреного молока та інкубували з наступними первинними антитілами: PPARγ, C/EBPα (Abcam, США) та GAPDH (Santa Cruz) Біотехнологія Inc., США) протягом ночі при 4 ° C. Плямки зондували вторинними антитілами, міченими пероксидазою хрону (Sangon Biotech Ltd., Шанхай, Китай), протягом 45 хвилин при кімнатній температурі та візуалізували за допомогою набору для виявлення ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Великобританія). Інтенсивність кожного сигналу визначали за допомогою програмного забезпечення Image J (NIH).
Фарбування гематоксиліном та еозином (H&E)
Імуногістохімію печінки мишей та жиру епідидиму проводили, як описано 35. Коротко кажучи, зрізи печінки або жирової тканини фіксували протягом ночі у 10% забуференному формаліні, вкладали у парафін та розтинали. Скла занурювали у відфільтрований гематоксилін на 6 хв, промивали водою та фарбували еозином на 1-2 хв. Зрізи промивали водою і зневоднювали у висхідних спиртових розчинах, очищали ксилолом і встановлювали покривним склом на марковану предметну склянку. Слайди досліджували за допомогою подвійного трансфлективного мікроскопа Olympus BX51 (Olympus, Токіо, Японія), а зображення знімали за допомогою цифрової камери Olympus DP72. Площу вакуолі на загальній поверхні тканини печінки визначали в печінці за допомогою програмного забезпечення для аналізу Image-Pro Plus. Індивідуальні діаметри жирових клітин (n = 75 у кожній групі) вимірювали за допомогою програмного забезпечення CellSens Standard (Olympus).
статистичний аналіз
Дані виражаються як середнє значення ± SD. Відмінності між двома групами порівнювали для статистичної значущості за допомогою неспарених t-критеріїв Стьюдента з корекцією Бонферроні. Відмінності вважали суттєвими, коли с