Дослідження реплікативного старіння шкірних фібробластів собак як внесок у

Від Ветеринарно-анатомічного інституту ветеринарного медичного факультету Лейпцизького університету Дослідження реплікативного старіння шкірних фібробластів собак як внесок у дослідження старіння Інавгураційна дисертація на здобуття наукового ступеня Doctor medicinae veterinariae (Dr. med.vet.) Ветеринарним медичним факультетом Лейпцизького університету подано Сюзанн Стрейт з Галле/Заале Лейпциг, 2006

шкірних

З дозволу ветеринарного факультету Лейпцизького університету Декан: проф. Карстен Фелхабер Науковий керівник: проф. мед. ветеринар. хабіл. Франц-Віктор Саломон Рецензент: 1. Проф. мед. ветеринар. хабіл. Інститут ветеринарної анатомії імені Франца-Віктора Саломона, факультет ветеринарної медицини, Лейпцизький університет 2. Dr. вип. нац. хабіл. Ульф Андерегг Кафедра експериментальної дерматології Університетська шкірна клініка Лейпцизький університет Лейпциг 3. Проф. Лікар. hc.c. Вільфрід Крафт І. Медична ветеринарна клініка, кафедра ветеринарної медицини, Університет Людвіга Максиміліана, День оборони Мюнхена: 19 грудня 2005 р.

Зміст 1 Вступ 1 2 Огляд літератури 3 2.1 Старіння 3 2.1.1 Визначення терміна старіння 3 2.1.3 Середня та максимальна тривалість життя 4 2.1.4 Старіння різних видів 4 2.1.5 Тривалість життя видів собак (Canis familiaris) 6 2.1.6 Вплив старіння на види собак 9 2.2 Дослідження старіння 11 2.2.1 Теорії старіння 11 2.2.2 Рівні старіння згідно з HAYFLICK (1985) 12 2.2.2.1 Теорії органів 12 2.2.2.2 Фізіологічні теорії 12 2.2.2.3 Теорії на основі геному 13 2.2.3 Клітинне старіння 14 2.2.4 Використання фібробластів для експериментів in vitro 17 2.2.5 Поведінка фібробластів in vitro та взаємозв'язок з максимальною та середньою тривалістю життя виду, віком донора та станом здоров'я донора 17 2.2.6 Визначення параметрів реплікації Старіння 20 2.2.7 Собаки при дослідженні старіння 21 2.2.8 Подовження тривалості життя 22 3 Тварини, матеріал, методи 24 3.1 Піддослідні тварини 24 3.2 Матерія запобіжна речовина 25 3.2.1 Використовувані хімічні речовини 25 3.2.2 Буфери та розчини 26 3.3 Методи 27 3.3.1 Культура клітин 27 3.3.1.1 Матеріал зразка 27 3.3.1.1.1 Відбір проб 27 3.3.1.1.2 Приготування зразків 27

3.3.1.2 Вирощування клітин 28 3.3.1.2.1 Умови культивування 28 3.3.1.2.2 Зміна середовища 28 3.3.1.2.3 Субкультивація 28 3.3.1.2.4 Підрахунок клітин та фарбування трипановим синім кольором 29 3.3.1.2.5 Заморожування клітин 29 3.3.1.2. 6 Розморожування клітин 29 3.3.1.2.7 Створення кривих росту 30 3.3.2 Цитологічні та імуноцитохімічні дослідження 30 3.3.2.1 Фарбування за Азаном по Хайденгайну 30 3.3.2.2 Фарбування за Гіемзою 31 3.3.2.3 Виявлення мікоплазми методом флуоресцентного аналізу 31 3.3.2.4 Імуногістохімія 32 3.3. 3 Фотодокументація 33 3.3.3.1 Фотографування живих клітин 33 3.3.3.2 Фотографування зроблених плям клітин 34 3.3.3.3 Вимірювання сфотографованих клітин 34 3.3.3.4 Статистичний аналіз та діаграми 34 3.4 Розрахунок параметрів культури клітин 34 4 Результати 36 4.1 Попередні тести 36 4.2 Морфологія культивовані клітини 37 4.3 Флуоресцентний аналіз 41 4.4 Імуногістохімія 42 4.5 Параметри проліферації культивованих клітин 43 4.5.1 Загальна кількість клітин та життєвий тонус d культури клітин 43 4.5.2 Встановлення розповсюдження 46 4.5.3 Криві росту 48 5 Обговорення 55 5.1 Критика методології 55 5.1.1 Відбір досліджуваних тварин 55 5.1.2 Проведення експерименту 57 5.2 Значимість систем культури в цілому і зокрема 60

6 Резюме 72 7 Резюме 74 8 Бібліографія 76

Список використаних абревіатур ABC комплекс BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO ДНК EDTA та ін. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA РНК TBS Трис Трис-HCl ЦНС Стрептавідин-Біотиновий Комплекс Стрептавідин-Біотиновий Комплекс Кумулятивний Населення Подвоюється Рівень 3,3'-Діамінобензидин-Тетрагідрохлорид 4 ', 6-Діамідин-2'-Фенігон-дибелколін Модифікований орел середній диметилсульфоксид дезоксирибонуклеїнова кислота, дезоксирибонуклеїнова кислота етилендіамінтетраоцтова кислота та інші, та ін. Центр досліджень навколишнього середовища та здоров’я плода великої рогатої худоби в Асоціації Гельмгольца Найвищий рівень подвоєння популяції In vitro тривалість життя фосфатно-сольовий сольовий розчин, фосфатно-полімерна сольова полімера Ланцюгова реакція Населення Подвоєний рівень Параформальдегід рибонуклеїнова кислота, рибонуклеїнова кислота Тріс-сольовий сольовий розчин, забуференний трис сольовий розчин Трис (гідроксиметил) амінометан Трис-гідрохлорид нормальна козяча сироватка

Проблемна продукція фібробластів, низькі вимоги до культивування та високий потенціал поділу цих клітин представляють значну перевагу перед іншими типами клітин (PEACOCKE et al. 1991, SMITH et al. 1984). Метою даної роботи було дослідження можливих зв’язків між віком тварини та проліферативною поведінкою її клітин (фібробласти шкіри) (у породи собак Бігл). Для цього були встановлені первинні та вторинні культури клітин собачих фібробластів шкіри різного віку. Такі параметри, як рівень подвоєння популяції (PDL), сукупний рівень подвоєння популяції (CPDL), найвищий рівень подвоєння популяції (HPDL), час генерації та тривалість життя in vitro (IVL) описують реплікативний потенціал культивованих клітин. За допомогою цих параметрів порівнювали культури клітин молодих, дорослих та старих тварин. Результати цієї роботи представляють можливу основу для подальших досліджень клітинного старіння собак за допомогою моделей in vitro 2.