ДОСЛІДЖЕННЯ РОЗРОБНО-МЕТАБОЛІЧНИХ ФУНКЦІЙ ФЕТОПРОТЕЙНОВОГО ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА

ДАНІЕЛЬ МАЛЕНФАНТ ДОСЛІДЖЕННЯ РОЗРОБКИ ТА МЕТАБОЛІЧНИХ ФУНКЦІЙ ФАКТОРА ПЕРЕСПИСАННЯ ЯДЕРНОГО ФЕТОПРОТЕЙНА (FTF) Дисертація, представлена ​​на факультеті аспірантури та докторантури університету Лаваль як частина докторської програми з клітинної та молекулярної біології для здобуття наукового ступеня (Ph.D.) ФАКУЛЬТЕТ МЕДИЦИНИ УНІВЕРСИТЕТ ЛАВАЛ КВЕБЕК 2012 Даніель Маленфант, 2012

функцій

Передмова Я хотів би подякувати доктору Люку Беланжеру за те, що він дозволив мені проводити наукову роботу в його лабораторії, а також за його фінансову підтримку впродовж мого аспірантури. Я також дякую доктору Жаку Коте і Геному Квебеку за фінансування частини мого докторського дослідження. Дякую Ален-Роджеру Батейле та Еріку Паке за їх безпосередню участь у збиранні та аналізі даних, представлених у розділі 3 даної дипломної роботи. Велике спасибі всім людям, які працювали в лабораторії доктора Беланже під час мого навчання в аспірантурі, особливо Сільві Рой, Дени Аллар, Фредерік Сен-П'єр, Ален Ламонтань, Джулі Пулен, Шанталь Курманш, Жан-Франсуа Паре та Марієв Якоб-Вагнер . Вони надали мені і моральну, і аморальну підтримку, і скрасили мої дні. Нарешті, дякую усім, з ким я грав у футбол, лазив, і особливо моїй команді з драконів "Les Barbares de Québec" за години веселощів і перевершення себе. Мені дуже подобається бути поруч із тобою і розмивати межі з тобою.

"Терпіння і тривалість часу - це більше, ніж сила чи лють", - Жан Де ла Фонтен

Зміст Резюме. i Анотація. ii Передмова. iii Зміст. v Список таблиць. vii Перелік рисунків. viii Список скорочень. ix Розділ 1 Вступ. 1 1.1 Печінка. 2 1.1.1 Архітектура. 2 1.1.2 Розвиток. 6 1.1.3 Функції. 9 1.1.4 Хвороби печінки та рак. 15 1.2 Транскрипція. 18 1.2.1 Загальне. 18 1.2.2 Елементи регулювання. 23 1.2.3 Фактори транскрипції. 27 1.3 Транскрипція печінки. 30 1.3.1 Ядерний фактор гепатоцитів (HNF). 31 1.3.2 Білок, що зв’язує CAAT/енхансер (C/EBP). 34 1.3.3 Ядерні рецептори. 37 1.3.4 Інші фактори. 43 1.4 FTF (фактор транскрипції фетопротеїну). 44 1.4.1 Загальне. 44 1.4.2 Структура та діяльність. 46 1.4.3 Промоутери. 48 1.4.4 Вираження тканин. 50 1.4.5 Функція. 51 1.5 Мета докторських досліджень. 54 Розділ 2 Ген Фетопротеїнового фактора транскрипції (FTF) є важливим для ембріогенезу та гомеостазу холестерину і регулюється елементом DR4. 56 2.1 Передмова. 57 2.2 Резюме. 57 2.3 Анотація. 58 2.4 Вступ. 59 2.5 Експериментальна процедура. 60 2.5.1 Інактивація гена FTF. 60 2.5.2 Гібридизація In Situ. 62 2.5.3 Діяльність LacZ. 62 2.5.4 Аналіз мікрочипів. 63 2.5.5 Північні плями. 63 2.5.6 Кількісна ПЛР. 63 2.5.7 Аналізи зміщення електромобільності та аналіз Скечарда. 64 2.5.8 Вестерн-блот. 65

Список таблиць Таблиця 2.1: Генотипи ембріонів (Е, ембріональний день) від схрещених FTF +/- мишей. 72 Таблиця 2.2: Рівні холестерину в сироватці крові у мишей дикого типу (+/+) та FTF-гаплоїдів (+/-), які годували контрольну дієту або дієту на рівні 2% холестерину протягом 5 днів. 73 Таблиця 2.3: Аналіз мікрочипів експресії генів печінки у дорослих самців Ftf +/- мишей. 75 Таблиця 3.1: Цілі гена FTF, пов’язані з мітохондрією у печінці дорослої миші. 98 Таблиця 3.2: Потенційні транскрипційні партнери FTF. 99

xv TR тиреоїдний рецептор TRE елемент реакції гормону щитовидної залози trna передача РНК TSS місце початку транскрипції (місце ініціювання транскрипції) UTP уридин трифосфат UTR нетранслируемая область VDAC1 залежний від напруги аніонний канал 1 VDR рецептор вітаміну D (NR1I1) (рецептор вітаміну D) VLDL дуже низька щільність ліпопротеїн (ліпопротеїн дуже низької щільності) w/v вага/об'єм (вага/об'єм) WNT безкрилий тип MMTV сайт інтеграції сімейство wt дикого типу (сова) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D -галактопіранозид XRCC5 АТФ-залежна ДНК-геліказа II (рентген-репарація, що доповнює дефектну репарацію в клітинах китайського хом'ячка 5)

Глава 1 Вступ

4 Рисунок 1.1: Морфологія печінки. Центр: загальна анатомія печінки людини. Вставки: A) Печінкова часточка B) Судинна та жовчовивідна системи: 1- Гілка ворітної вени; 2- Гілка печінкової артерії; 3- Жовчний проток; 4- обмежувальна пластина; 5- Центролобулярна вена; 6- Печінкові клітинні стінки; 7- синусоїди; Рожева стрілка: кровотік; Зелена стрілка: потік жовчі (між ящиками); Коробка: 8- жовчний канал; 9- Геринг-канал; 10- Жовчний проток C) Синусоїда: 11- Зоряні клітини; 12- Світло синусоїдальних капілярів; 13 - Простір Дисе; 14- жовчний каналік; 15- Гепатоцити; 16 - герметичне з'єднання; 17- клітини Кюпфера; 18- Ендотеліальна клітина печінкових синусоїд. Адаптовано з www.embryologie.ch та посібника Мерка з медичної інформації - друге домашнє видання, Інтернет-версія 1.1.1.4 Зонація Хоча розташування гепатоцитів виглядає однорідним, існує функціональна зональність часточок на основі положення судин, тобто кінцеві гілки ворітної та центробулярної вен і напрямок кровотоку (розглянуто в

5 [8]). Дійсно, гепатоцити кожної часточки можна приблизно розділити на дві субпопуляції: перипортальну популяцію перед потоком крові (ворітна вена) та перицентролобулярну популяцію нижче за течією (центрилобулярну вену). Гепатоцитарні функції цих двох областей різні, часто доповнюють один одного і диктуються різницею в експресії та активності різних ферментів, відповідальних за метаболізм (рис. 1.2). Рисунок 1.2: Метаболічна зональність часточок печінки. Зонування може регулюватися кровотоком, рівнем кисню, гормонами, факторами росту та певними клітинними сигналами. Активність різних метаболічних шляхів печінки розподіляється у градієнті від перипортальної (блідо-сіра) або перивенної (темно-сіра) області. O 2, кисень. Взято з [9] Перипортальні гепатоцити, завдяки їх близькості до печінкової артерії та ворітної вени, будуть найкращими оксигенованими, але також найімовірнішими, що будуть контактувати з

11 Рисунок 1.5: Метаболізм печінки. Печінкові метаболічні шляхи. 1, глікогеногенез; 2, глікогеноліз; 3, гліколіз; 4, глюконеогенез; 5, ліпідогенез; 6, холестерогенез та синтез жовчних кислот; 7, цикл Кребса; 8, окислення жирних кислот. Сині стрілки, шляхи використання та зберігання глюкози. КГ, альфа-кетоглутарат; Asp, аспартат; АТФ, аденозинтрифосфат; CO 2, вуглекислий газ; CoA, кофермент А; F, фруктоза; FA, жирні кислоти; FACoA, жирний ацильний кофермент А; FADH 2, флавін аденін динуклеотид дигідроген; G, глюкоза; ВВП, гуанозиндифосфат; GTP, гуанозинтрифосфат; HMG-CoA, 3-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А; IDL, ліпопротеїни проміжної щільності; KB, кетонове тіло; ЛПНЩ, ліпопротеїди низької щільності; NAD, нікотинамід аденін динуклеотид; NADH, нікотинамід аденіндинуклеотид водню; OAA, оксалоацетат; Р, фосфат; Пі, фосфатний іон; PEP, фосфоенолпіруват; ТГ, тригліцериди; ЛПНЩ, ліпопротеїни дуже низької щільності. Адаптовано з www.scienceslides.com/kzr/hepatic-metabolism 1.1.3.1.3 Амінокислоти Білки з їжею розщеплюються на амінокислоти під час травлення. Ці амінокислоти всмоктуються кишечником і транспортуються до печінки через

13 Рисунок 1.6: Процес клітинного дихання. Етапи перетворення глюкози в АТФ під час клітинного дихання. АДФ, аденозиндифосфат; е -, електрон; Н +, іон водню (протон). Отримано з http://www.vt-net.org/tpe-sucre/bilan-respiration-cellulaire.php

Глава 2 Ген фактору транскрипції фетопротеїнів (FTF) є важливим для ембріогенезу та гомеостазу холестерину і регулюється елементом DR4 Жан-Франсуа Паре, Даніелем Маленфантом, Шанталь Куртеманш, Марієв Якоб-Вагнер, Сільві Рой, Дени Аллардом та Люком Беланжером кафедра медичної біології медичного факультету Центру дослідження раку Університету Лаваль, L Hôtel-Dieu de Quebec, Квебек G1R 2J6, Канада The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No20, Випуск від 14 травня, с. jbc.M401523200

68 Рисунок 2.1: Інактивація гена Ftf. А. на верхній карті розміщений фрагмент гена mftf розміром 7,5 кб, який використовується для генерування вектора рекомбінації, що порушує mftf-екзон IV із lacz-neo, вставленим у сайт рестрикції BglII, і результуючий мутантний алель Ftf. Відкриті стрілки, напрямок транскрипції. Інтронічний зонд A, що використовується у блотах Саузерн, виявляє фрагмент рестрикції StuI розміром 3,8 кб від алелю Ftf дикого типу та фрагмент 7,8 кб від рекомбінантного алелю Ftf-lacZ. ПЛР-праймери 1-2 та 3-4 (наконечники стрілок) ампліфікують фрагмент 1,7 kb від гена mftf, продукт 204 bp від псевдогену mftf та фрагмент гена нео 700 700 bp. Б. Саузерн-блот-аналіз геномної ДНК з клонів ембріональних стовбурових клітин, отриманих шляхом трансфекції вектором націлювання FTF. C. Саузерн-блот-генотипування одноплідників, народжених від Ftf +/- миші. D, генотипування ембріона за допомогою ПЛР-аналізу, продукт ампліфікації з гена neo сигналізує про один або два мутантних алелі Ftf, а відсутність продукту гена Ftf розміром 1,7 кб ідентифікує Ftf-нульовий ембріон.

70 Рисунок 2.2: Місця експресії FTF та фенотип нокауту. Панелі A-F, -галактозидазне фарбування Ftf +/- ембріонів або дорослих тканин. А, морули (Е2,5). B, бластоцисти (E3.5, два Ftf +/-, один Ftf +/+). С, ембріон на рівні E11,5 (л, брунька печінки; г, зачаток ребра; б, очні кістки; о, вушний міхур; м, довгий мозок) D, зона окостеніння в кінцівці при E14,5 (c, хрящ). Е, кишка дорослої людини. F, яєчник дорослої людини. Панелі G-V: аналізи гібридизації яскравого поля та темного поля/in situ диких зародків та Ftf-нокаутуючих ембріонів; показані результати були отримані за допомогою антисмислових рибозондів, контрольні сенсорні зонди не подавали сигналів. В

73 Таблиця 2.2: Рівень холестерину в сироватці крові у мишей дикого типу (+/+) та FTF-гаплоїдів (+/-), яких годували контрольною дієтою або дієтою на 2% холестерину протягом 5 днів. Результати є середніми значеннями мм ± 1 SD (у дужках: кількість тварин). Контроль рівня холестерину Ftf +/+ Ftf +/- 2,37 ± 0,33 (21) 2,14 ± 0,30 (14) р