Дослідження синтезу та структури мутагенності заміщених ароматичних амінів
Дослідження синтезу та структурно-мутагенності заміщених ароматичних амінів та ітро з'єднує нові стратегії зменшення мутагенності O 2 R R H 2 Markus Klein
Дослідження синтезу та структурної мутагенності заміщених ароматичних амінів та сполук ітро Нові стратегії зменшення мутагенності Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора природничих наук (доктор наук) На кафедрі хімії Філіппського університету в Марбурзі, представленій Маркусом Клейном із Гронау-Марбурга/Лан 2
Частини цієї роботи вже опубліковані: M. Klein, G. Boche (1999) Регіоспецифічний синтез заміщених нітрофлуоренів та амінофлуоренів з реакцією сполучення егіші як ключовий етап, Synthesis 7, 1246-125. M. Klein, U. Voigtmann, T. Haack, L. Erdinger, G. Boche (2) Від мутагенних до немутагенних нітроаренів: Вплив громіздких алкільних замінників на мутагенну активність 4-нітробіфенілу в Salmonella thyphimurium. Частина I. Замінники, орто до нітрогрупи та у 2'-положенні, Mut. Резолюції 467, 55-68. М. Кляйн, Л. Ердінгер, Г. Боше (2) Від мутагенних до немутагенних нітроаренів: Вплив громіздких алкільних замінників на мутагенну активність нітроароматичних речовин у Salmonella thyphimurium. Частина II Замісники далеко від нітрогрупи, Mut. Резолюція 467, 69-82. Прийнято як дисертацію хімічним факультетом Філіппського університету Марбурга: 26.6.2 Перший рецензент: Другий рецензент: Проф. Г. Боше проф. Д-р Т. Карелл День усного іспиту: 5.7.2
Великі діла Господні; той, хто досліджує це, насолоджується цим. Псалом 111, 2
Зміст I.2 Синтези та експерименти 27 I.2.1 Обладнання, хімікати, методи. 27 I.2.2 4-ітробіфеніли та 4-амінобіфеніли з алкілом та замінниками CF 3. 21 I.2.3 4-ітробіфеніли та 4-амінобіфеніли з гідрокси/алкокси-заступниками. 22 I.2.4 4-ітробіфеніли та 4-амінобіфеніли з діалкіламінозамінниками. 233 I.2.5 Інші 4-ітробіфеніли та 4-амінобіфеніли. 238 I.2.6 2-ітрофлуорен та 2-амінофлуорен. 241 I.2.7 Гетероароматичні сполуки. 25 I.2.8 4-ітростильбен. 257 I.3 Дослідження мутагенності 26 J Бібліографія. 261 III
Список абревіатур Рис. Ad AIB Arom ATP AcCo A dba CYP d DC DCC DCM DME DMF dppe dppf dppp EE EtOH h IF HMPTA HMDS MO BS PAH PAPS PE PPA Py QSAR THF TAV TBABr 3 TPPTS TFP UDP Рисунок Адамантил азобіс-ізообутуронітритрилат ацетил-коензим А дібензіліденацетон цитохром P дні тонкослойная хроматографії діціклогексілкарбодііміда діхлорметан диметоксиетан диметилформамид, 1,2-біс (дифенілфосфіно) етан, 1,1'-біс (дифенілфосфіно) ферроцен 1,3-біс (дифенілфосфіно) пропан етилацетат: етанол годин індукція фактор гексаметілфосфортріамід гексаметілдісілазани монооксигенази бромсукцинімід Поліциклічний ароматичний 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат петролейний ефір (4-6 C) поліфосфорна кислота піридин Кількісна структура взаємодія активність тетрагідрофуран Типові інструкції з експлуатації Тетрабутиламмоній трибромід тринатрій 3,3 ', 3' '- фосфантрілфторфторилбензілсульфатфосфат
Вступ A.3 Цілі та структура цієї роботи Серед багатьох мутагенних та канцерогенних речовин ароматичні аміни та іроароматичні речовини мають величезне значення. Численні представники цих класів речовин виробляються і широко застосовуються у промисловості, але вони також утворюються під час процесів горіння (дизель, копчення тощо) або при нагріванні м’яса, і тому широко поширені в навколишньому середовищі. Високий канцерогенний потенціал таких сполук, швидше за все, частково відповідає за постійний приріст раку в промислово розвинутих країнах. Завдяки своєму механізму дії вони є генотоксичними і повинні бути активовані метаболічно (див. Розділ Б), особливо з аміно- та ітроароматичними речовинами, існує висока кореляція між канцерогенністю та мутагенністю. Промислове використання цих речовин представляє потенційно високий ризик для здоров’я людей і тому все більше обмежується законом. Рак сечового міхура, спричинений ароматичними амінами, є визнаним професійним захворюванням, яке страждало протягом останніх 2 років
8 робітників загинули. 14 Тому промисловість покликана розробляти більш безпечні замінники. Саме з цього моменту починається нинішня робота. Яким чином ароматичні аміни та іроароматичні речовини повинні бути модифіковані, щоб зменшити їх мутагенний потенціал і, отже, їх канцерогенні властивості або навіть повністю загасити? Використовуючи модельні речовини, отримані з відомих канцерогенів, таких як 4-ітробіфеніл 1, 4-амінобіфеніл 2, 2-ітрофлуорен 3, 2-амінофлуорен 4 та 4-ітростилбен 5, ми досліджуємо, як структурні зміни виникають внаслідок модифікації функціональної групи, але перш за все шляхом введення різних заступників (наприклад, алкільних, CF 3, алкоксильних або діалкіламіногруп) впливають на мутагенність основних тіл. Рис. 2: Як структурні модифікації впливають на мутагенність? O 2 O 2 O 2 1 3 5 H 2 H 2 2 4 8
Ароматичні аміни та сполуки ітро утворюють напр. тому що певні базові послідовності там трапляються частіше - сильніший канцерогенний потенціал, ніж ті, що реагують менш конкретно. Наприклад, у випадку ариламінів, таких як 2-амінофлуорен або 4-амінобіфеніл, утворення пухлин печінки може корелюватися з G T трансверсіями в першій основі кодону 61 у прото протокогені i. 56 Навіть після утворення аддукту структура продовжує відігравати важливу роль. 4-амінобіфеніл та 2-амінофлуорен реагують, утворюючи порівнянні аддукти в печінці миші, але аддукти ДА 2-амінофлуорену (наприклад - (дезоксигуанозин-8-іл) -2-амінофлуорена 5) індукують вдвічі більше пухлин, ніж відповідні аддукти 4-амінобіфеніл (наприклад - (дезоксигуанозин-8-іл) -4-амінобіфеніл 41). 57 Дослідження мутагенності ряду амінів та ітроароматичних речовин у Salmonella typhimurium TA1538 виявили подібні ефекти (див. Розділ С). При порівнянні індукції мутацій утвореними аддуктами дезоксигуанозину були виявлені сильні відмінності щодо ефективності: -ацетилбензидин> 1-ітропірен
Тест на мутагенність Еймса використовується для визначення специфічності мутації. 7 З цього можна зробити висновок, на які основи атакує остаточний канцероген, а які мутації заміщення основ викликані мутагенами. Такі дослідження проводити набагато простіше, ніж класичні методи аналізу аддуктів. Порівняно зі стандартними випробувальними штамами TA98 та TA1 та деякими їх варіантами (TA98R, TA98/1.8DP 6), нові спеціальні штами до цього часу використовувались лише у відносно невеликій кількості досліджень, і порівняння навряд чи можливо. Огляд останніх досягнень у розробці нових штамів Еймса надано Джозефі. 71 У цій роботі були використані стандартні тестові штами TA1 та TA98 з метаболічною активацією та без неї. Деякі речовини також досліджували за допомогою TA98R. В.3 Впровадження Для забезпечення максимально можливої відтворюваності результатів випробувань, Еймс розробив стандартизовану робочу процедуру, яка коротко викладена нижче. Необхідні для гістидину штами бактерій (his-) культивують протягом декількох годин у поживному розчині до певної щільності клітин (
Структурно-мутагенні відносини Рис. 17: Вплив положення функціональної групи на мутагенність H 2 H 2 2 65 TA98 + S9: 79 1,5 об./Нмоль 6) Гідрофобність може слабше проникати в стінки бактерій. 39
Структурно-мутагенні взаємозв'язки хімічно синтезованих гідроксиламінів 79 та 81, як і 77 та 39, є потужними мутагенами. Очевидно, що подальші етапи - тобто етерифікація групи ОН та реакція з DA - є набагато менш сприйнятливими до стеричних факторів. Рис. 21: Причини бездіяльності 1-афтиламіну та 2-амінобіфенілу H 2 HOH H 2 P 45 HOH 6 77 78 79 мутагенний мутагенний не мутагенний мутагенний H 2 HOH H 2 HOH P 45 2 39 8 81 мутагенний мутагенний не мутагенний мутагенний A Ще однією структурною особливістю, яка якісно корелювала з мутагенним потенціалом і найкраще може бути інтерпретована як стеричне явище, є ступінь ароматичності речовини та пов'язана з цим планарність. Після Хіраями 2-ітропірен 82 значно активніший у TA98, ніж у TA1, і, отже, діє в основному як мутаген зміщення рамок. 95 Рис. 22: Вплив планарності на мутагенність (TA98) ii 82 83 TA98-S9: 2569 Об/нмоль 37,7 Об/нмоль Шляхом поетапного гідрування бічних подвійних зв’язків до 2-ітро-4,5-дигідропірену і далі до 2- ітро-4,5,9,1-тетрагідропірен 83 переходить до планарності і в той же час також i Тут тут відбувається лише кільцеве окислення. ii Геометрію конструкцій оптимізували за допомогою Chem3D, використовуючи метод AM1. 41
Співвідношення структура-мутагенність Таблиця 7: Огляд модельних речовин Серія випробувань доречно Скорочення Структура R 3 1-I 4-ітробіфеніл 4 4Bp 1 2 R-O 2 4-Aminobiphenyl 4ABp 2 1 '-H 2 4-itrosobiphenyl 4OBp 89 1 4' 2 '3' -O 4-Гідроксиламінобіфеніл 4HOHBp 9 -HOH, -Диметил-4-амінобіфеніл, -DiMe-4ABp 91 -Me 2-терт-бутил-4-амінобіфеніл-tbu-4abp 92 -HtBu -Ацетил-4-амінобіфеніл Ac-4ABp 93 -HOAc 3 2-I 4-ітробіфеніл 4 4Bp 1 2 O 2 -H 4'-метил-4-нітробіфеніл 4'Me-4Bp 94 1 '-Me 4'-етил-4-нітробіфеніл 4'Et -4Bp 95 R 4 '1 2' 3 '-Et 4'-ізо-пропіл-4-нітробіфеніл 4'iPr-4Bp 96 -ipr 4'-трет-бутил-4-нітробіфеніл 4'tBu-4Bp 97 -tbu 4 '-n-бутил-4-нітробіфеніл 4'nBu-4Bp 98 -nbu 3 2-II 3'-метил-4-нітробіфеніл 3-Me-4Bp 4 99 O 2 -H/-Me R 3', 5'- Диметил-4-нітробіфеніл 3 ', 5'DiMe-4Bp 1 1' -Me 3 ', 5'-Ді-трет-бутил-4-нітробіфеніл 3', 5'DitBu-4Bp 11 2 1 4 '2' 3 ' R -tbu 4 2-III 4'-адамантил-4-нітробіфеніл O 4'Ad-4Bp 12 2 -Ad 4-ітротерфенілен 4 '4Tp 13 -Ph 2-феніл-5-нітропіридин 2Ph5P 2 14 -H 4'-трет -Бутил-2 -феніл-5-нітропіридин 4'tBu-2Ph5P 15 R 4 '5 O 2 R -tbu 3 2-ітро-5-фенілпіридин 4 5Ph2P 16 O 2 -H 4'-трет-бутил-2-нітро-5-фенілпіридин 4'tBu-5Ph2P 17 5 1 'R 4' 2 '3' 2-VI 2-ітрофлуорен 2F 3 7 2 -H 2 -tbu 7-метил-2-нітрофлуорен 7Me-2F 18-Me 7-трет-бутил- 2-нітрофлуорен 7tBu-2F 19 -tbu 7-адамантил-2-нітрофлуорен 7Ad-2F 11 -Ad RO 2 5
Синтез модельних речовин Таблиця 9: Результати поперечних зчеплень із CF 3 -заміщеними 4-ітробіфенілами F Спосіб введення Продукт 3 C O 2 Вихід b 1 Suzuki a 4'CF 3-4Bp 126
Гідроксиламіно> аміно> ітро від. Диметилювання амінофункції лише незначно знижує мутагенність порівняно із вільним аміном, оскільки метильні групи легко відщеплюються окисленням. Трет-бутилювання або ацетилювання аміногрупи призводить до менш мутагенних сполук (92, 93), але цього ефекту недостатньо для повного придушення мутагенності. 14-е
Результати та обговорення досліджень мутагенності F.2.1.2 Більші алкільні замісники. Чи може таке зниження мутагенності також переноситися на інші системи з орто-алкільними групами, і, отже, загально дійсний взаємозв'язок структура-мутагенність детально розглянуто в нашій робочій групі. Шмітт має 1-алкіл-2-амінонафталіни (1-алкіл-2А) 6, 38-311, 1-алкіл-2-амінофлуорени (1-алкіл-AF) 4, 312-315 та 3-алкіл-4-амінобіфеніли 3Alkyl-4ABp) 2, 316-319 синтезовано та проведено тести Еймса. 26 Відповідні дослідження щодо 3,5-діалкіл-4-амінобіфенілів 32-322 (3,5DiAlkyl-4ABp) наведені у Glende 151 (Таблиця 26). Для порівняльного аналізу мутагенний потенціал у ревертантах/(1 нмоль) знову розраховували на основі ваших даних шляхом регресійного аналізу, використовуючи метод, описаний в С.5. Показані лише дані, отримані у присутності S9-Mix, оскільки більшість амінів без S9-Mix були, як очікувалось, неактивними. 82: Ортоалкільовані 2-амінонафталіни, 2-амінофлуорени та 4-амінобіфеніли Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 6 38 39 31 311 Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 4 312 313 314 315 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Et ipr nbu tbu 2 316 317 318 319 Me H 2 Et H 2 ipr H 2 Me Et ipr 32 321 322 18
Результати та обговорення досліджень мутагенності Таблиця 27: Огляд мутагенності орто-алкільованих 4-ітробіфенілів З'єднання F.2.1.3 Ревертанти/(1 нмоль) TA98-S9 TA98 + S9 TA1-S9 TA1 + S9 4Bp 1 8.53-1.31- 3Me-4Bp 323 4.64-24.3-3Et-4Bp 324.51-13.71-3iPr-4Bp 325.43-4.12-3tBu-4Bp 326 69). Такі схеми ітро відомі з кристалічних структур ортоалкільованих сполук ітро. 112
1% Якщо структура основного тіла має такий чіткий вплив на співвідношення конформацій DA, можна припустити, що заступники, що змінюють форму молекули, також мають подібний вплив. Особливо з аддуктами з великими 134
Результати та обговорення досліджень мутагенності, коли реплікація призводить до меншої кількості або навіть відсутність мутацій, сполуки, такі як 4ABp 2 та 4'tBu-4ABp 116, повинні бути значно менш мутагенними, ніж плоскі молекули, такі як 2AF 4. Стерично вимогливі заступники (трет-бутил, адамантил) також можуть погіршити динамічне перетворення конформацій, збільшуючи енергію активації цього процесу через несприятливі стеричні взаємодії. 141