Дослідження запалення кишечника в DSS-індукованій моделі протоколу IBD (переклад на французьку)

Резюме

Експериментальні моделі запальних захворювань кишечника дозволили дослідити вроджений та адаптивний комплекс імунних реакцій, пов’язаних з патогенезом. Використовуючи гістологічну оцінку, кількісну оцінку прозапальних цитокінів та активності мієлопероксидази, можна почати оцінювати ці реакції, що спостерігаються при запальних захворюваннях кишечника.

Анотація

Запальна хвороба кишечника (ВЗК) охоплює цілий ряд патологій кишечника, найпоширенішими з яких є виразковий коліт (UC) та хвороба Крона (CD). Як UC, так і CD, коли вони присутні в товстій кишці, створюють профіль подібних симптомів, які можуть включати діарею, ректальну кровотечу, біль у животі та втрату ваги. 1 Хоча патогенез ВЗК залишається невідомим, його описують як багатофакторне захворювання, яке включає як генетичні, так і екологічні компоненти. 2

Існує безліч моделей тварин та змінних факторів запалення товстої кишки, які нагадують декілька ознак ВЗК. Моделі коліту на тваринах варіюються від моделей, що виникають спонтанно у сприйнятливих штамів певних видів, до тих, які потребують введення певних концентрацій хімічних речовин, що викликають коліт, таких як декстран сульфат натрію (DSS). Хімічно індуковані моделі запалення кишечника є найбільш часто використовуваними та найкраще описуваними моделями ВЗК. Введення DSS у питну воду викликає гострий або хронічний коліт, залежно від протоколу введення. У 3 тварин, які отримали ССД, спостерігається зниження ваги та ознаки рідкого стільця або діареї, іноді із ознаками ректальної кровотечі 4,5. Тут ми описуємо методи, за допомогою яких розвиток коліту та наслідки запальної реакції можуть бути охарактеризовані після введення DSS. Ці методи включають гістологічний аналіз ділянок товстої кишки, пофарбованих гематоксиліном/еозином, вимірювання прозапальних цитокінів та визначення мієлопероксидази (МРО), яка може бути використана як маркер запалення. 6

Ступінь запальної реакції у стані хвороби можна оцінити за наявністю клінічних симптомів або за зміною гістології у слизовій тканині. Гістологічне пошкодження товстої кишки оцінюється за допомогою бальної системи, яка враховує втрату архітектури крипти, запальну клітинну інфільтрацію, м’язове злежування, виснаження келихоподібних клітин та крипту. 7 Кількісно рівні гострих прозапальних цитокінів із запальними властивостями, таких як інтерлейкін (IL) -1β, IL-6 та фактор некрозу пухлини (TNF) -α, можна визначити за допомогою класичних методів ІФА. Крім того, активність MPO можна виміряти за допомогою колориметричного аналізу та використовувати як показник запалення. 8

При експериментальному коліті тяжкість захворювання часто корелює з підвищеною активністю МРО та високим рівнем прозапальних цитокінів. Ступінь тяжкості коліту та запалення, пов’язаного з пошкодженням, можна оцінити, досліджуючи консистенцію стільця та кровотечу, на додаток до оцінки гістопатологічного статусу кишечника за допомогою пофарбованих гематоксиліном/еозином ділянок тканини товстої кишки. Фрагменти тканин товстої кишки можуть бути використані для визначення активності МРО та продукції цитокінів. У сукупності ці вимірювання можуть бути використані для оцінки запальної реакції на тваринних моделях експериментального коліту.

Протокол

1. Миша модель гострого DSS-індукованого коліту

2. Зібрати зразки тканин з товстої кишки

3. Оцінка тяжкості коліту

4. Підготуйте стандартні розчини реагентів для тестування.

  1. Приготуйте 50 мМ розчин фосфатного калійного буфера, додаючи розчин B (K 2 HPO 4, 8,7 г двоосновного фосфату калію в 1 л dH 2 O) до розчину A (KH 2 PO 4, 6, 8 г одноосновного фосфату калію в 1 л DH 2 O) до досягнення рН 6,0. Залишки розчинів можна зберігати в холодильнику (2-8 ° C) до подальшого використання.
  2. Приготуйте буфери гексадецилброміду (CCFH), додавши 5 г HTAB в 1 л фосфатного буфера калію (50 мМ, рН = 6,0). Акуратно нагрійте до розчинення та зберігайте при температурі 2-8 ° C до використання. Коли потрібно, нагрійте, щоб знову розчинитися.
  3. Приготуйте буфер для лізису для гомогенізації тканин для аналізу білка, додаючи 10 мл соляної кислоти Трис-1М (рН = 8,0), 6 мл 5М хлориду натрію та 2 мл тритону Х-100 до 182 мл стерилізованої дистильованої води. Тритон Х-100 дуже в'язкий при кімнатній температурі, тому перед використанням його слід трохи підігріти. Підготовлений буфер для лізису можна зберігати при -20 ° C до використання.

5. Підготовка зразків до аналізу

6. Кількісна оцінка маркерів запалення

7. Репрезентативні результати

dss-індукованій
Фігура 1. Самці мишей C57BL/6 отримували 5% DSS у питній воді протягом 5 днів. Оцінки DAI оцінювали щодня для кожної тварини і усереднювали за день для кожної групи (середнє значення ± SEM, n = 4 миші/група).

Малюнок 2. Мишам C57BL/6 давали 5% DSS у питну воду протягом 5 днів. Контрольні миші отримували воду без SSD. Оцінка макроскопічної шкоди/тяжкості захворювання оцінювалася сліпо на 5-й день після індукованого DSS коліту. Колони, виділені від мишей, які отримували SSD, мали вищі показники загальної шкоди (ректальна кровотеча, ректальний пролапс, діарея, кровотеча з товстої кишки), що вказує на більший ступінь тяжкості захворювання (середнє значення ± SEM, n = 4 миші/група).

Малюнок 3. C57BL/6 отримували 5% розчин SSD у питній воді для індукції коліту. Контрольні миші отримували воду без SSD. (А) Гістологічні показники були сліпо класифіковані за допомогою забарвлених H&E зрізів тканин товстої кишки, зібраних на 5-й день після введення DSS. (B) Зразки, оброблені DSS, виявляють більше гістологічних пошкоджень (більше клітинної інфільтрації, більший виснаження келихоподібних клітин, більші спотворення/пошкодження архітектури крипти) порівняно з контролем (C) (середнє значення ± SEM, n = 4 миші/група). У (B) та (C) зірочка (*) позначає зону виснаження келихоподібних комірок та спотворення архітектури крипти; знак фунта (#) означає інфільтрацію клітин.

Малюнок 4. Всіх мишей забивали при введенні після 5-го дня DSS і відбирали зразки тканин товстої кишки для оцінки активності MPO. Тяжкість коліту, спричиненого DSS, пов'язана з вищими рівнями активності MPO порівняно з контролем (середнє значення ± SEM, n = 4 миші/група).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>Малюнок 5. На додаток до вищих рівнів MPO, тяжкість індукованого DSS коліту також пов'язана з підвищеним рівнем запальних цитокінів, таких як IL-1β, IL-6, TNF-α (середнє значення ± SEM, n = 4 миші/група ).

Таблиця 1. Макроскопічна оцінка тяжкості/захворювання

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

DSS-коліт - широко застосовувана хімічно індукована модель запалення кишечника. У цій моделі мишам дають питну воду з добавкою MAS, яка вважається токсичною для клітин епітелію кишечника та порушує цілісність слизового бар’єру. Введення DSS викликає гострий коліт, який характеризується рідким стільцем, каловими кровотечами та інфільтрацією гранулоцитів. 10 Під час введення DSS коліт, як правило, асоціюється зі значною втратою ваги та наявністю крові в калі, що можна оцінити за допомогою аналізу на приховану кров у калі. 5.10,11 Після збору зразків тканин товстої кишки тяжкість коліту може бути охарактеризована грубим дослідженням товстої кишки та гістологічним аналізом зрізів товстої кишки, пофарбованих H&E, з використанням раніше встановлених бальних систем. 9

Дотримуючись цього протоколу, важливо зазначити, що тяжкість коліту, спричиненого DSS, залежить від виду та штаму. Крім того, відмінності в мікрофлорі кишечника між різними тваринами та приміщеннями для тварин можуть змінити результат введення MAS. Таким чином, для оптимізації дозування та тривалості лікування МАС можуть знадобитися початкові дослідження з використанням DSS. Неможливість оптимізувати ці змінні може призвести до високої смертності або до незначного або відсутність коліту. Оптимізована, ця модель може бути використана як відтворювана модель при колітах з низьким рівнем смертності. Крім того, важливо використовувати СППР із зазначеною молекулярною масою (див. Таблицю реагентів). Інші форми сольового реагенту DSS можуть не викликати коліту або можуть призвести до високої смертності.

Для найбільш точного вимірювання активності МРО ми виявили, що незалежно від того, яка модель коліту використовується, рівні МРО слід визначати протягом першого тижня збору тканин, оскільки активність МРО має тенденцію до зменшення з часом. Активність МРО може бути використана як маркер запалення. Однак кількісне визначення цитокінів тканин та гістологічне оцінювання є невід'ємною частиною полегшення комплексної оцінки запальної реакції під час коліту.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.