Генерування мутантів делеції генів у кадрі у синьогнійної палички та тестування на вірулентність

Резюме

Тут ми описуємо простий і відтворюваний протокол мишачої моделі зараження для оцінки послаблення генетично модифікованих штамів синьогнійної палички порівняно з затвердженою Управлінням з контролю за продуктами та ліками США (FDA) кишковою паличкою для комерційного використання.

Анотація

Вступ

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Перед початком експериментів на тваринах відповідний протокол повинен бути затверджений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC). Схвалення описаного протоколу було отримано від IACUC в Університеті Маршалла (Хантінгтон, штат Вірджинія, США).

  1. Щоб створити генетичну делецію за допомогою плазміди pEX100T-NotI, клонуйте ділянки ДНК, що фланкують бажану послідовність делеції, та вставте їх у сайт рестрикції NotI плазміди. Плазмідна вставка повинна містити близько 500 нуклеотидів до послідовності-мішені, які безпосередньо примикають до приблизно 500 нуклеотидів після послідовності видалення цілі. Крім того, вставка повинна містити послідовність розпізнавання NotI (GCGGCCGC) на своїх 5 'і 3' кінцях (Рисунок 1B.).

  1. Варіант 1: використовуйте традиційні методи клонування. Використовуйте ПЛР для ампліфікації геномних областей до та після гена, що цікавить, з подальшим перехресним ПЛР 9, 10 для приєднання генерованих фрагментів, рестрикційним ендонуклеазним розщепленням продукту ПЛР та плазміди та лігуванням 11 (рис. 1)B, C).
  2. Варіант 2: Після розробки послідовності делеції в silico, дозвольте компанії, яка синтезує de novo, вставляти її в плазміду pEX100T-NotI. Багато компаній спростили процес клонування для швидкого та ефективного отримання плазміди, що представляє інтерес. Крім того, послідовності перевіряють, чи є плазміди без мутацій перед доставкою.

  1. Трансформуйте електрокомпетентну кишкову паличку з плазмідою відповідно до рекомендацій виробника. За допомогою стерильної петлі для інокуляції нанесіть 10 л реакції перетворення ізольованих колоній на попередньо підігріту агарову пластинку бульйону Лурії (LB), доповнену 100 г/мл карбеніциліну, та інкубуйте протягом ночі при 37 ° C.
    ПРИМІТКА: З усім обладнанням та середовищами, що використовуються для культивування бактерій, слід поводитись відповідно до інституційних правил безпеки.
  2. Пройти двічі.
    1. Вийміть пластинку з інкубатора та визначте ізольовану колонію. За допомогою стерильної петлі для інокуляції підберіть колонію та зніміть попередньо розігріту агарову пластинку LB із 100 г/мл карбеніциліну для ізольованих колоній. Інкубуйте протягом ночі при 37 ° C. Повторіть цей крок ще раз, щоб сформувати чисту культуру.
  3. За допомогою стерильної петлі для інокуляції інокулюйте 5 мл LB однією колонією з останньої агарової пластини. Помістіть культуру в струшуючий інкубатор при температурі 37 ° С на ніч. На наступний день змішайте 1 мл цієї культури з 1 мл 5% у кріовіалі і зберігайте при -80 ° C, щоб створити заморожений запас сорту.

4. Препарат для розтягування бактерій та кон’югація з трьома батьками

5. Виявлення одиночних кросоверних рекомбінантів P. aeruginosa

6. Виявлення подвійного P. aeruginosa над рекомбінантами

  1. Для кожної бульйонної культури інокулюйте 10 л культури на попередньо розігріту тарілку PIA, доповнену 10% сахарозою (без гліцерину) та смужками для ізольованих колоній. Інкубуйте планшети протягом ночі при 37 ° С.
  2. На наступний день вийміть пластинки з інкубатора і дослідіть на предмет зростання. Сахарозостійкі колонії повинні бути подвійними перехресними рекомбінантами (тобто видаляли плазміду з хромосоми шляхом рекомбінації між іншою гомологічною областю вставки плазміди та хромосомою P. aeruginosa).
    1. Відкусіть щонайменше 20 колоній стерильними зубочистками на попередньо розігрітих пластинах: 1) PIA, 2) PIA з додаванням 10% сахарози (без гліцерину) та 3) PIA з 300 г/мл карбеніциліну.
  3. Інкубуйте планшети протягом ночі при 37 ° С.
  4. Вийміть пластинки з інкубатора і дослідіть їх на предмет зростання. Справжні подвійні кросовер-рекомбінанти будуть чутливими до карбеніциліну та стійкими до сахарози (тобто колонії, які виросли на PIA та PIA, доповнені сахарозою, але не виросли на PIA, доповнені карбеніциліном).

7. Підтвердження видалення гена за допомогою ПЛР колонії

8. Підготувати штам бактерій для випробувань на тваринах

VE2 та PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

  • Інкубуйте культури в струшуючому інкубаторі при 160 об/хв і 37 ° C, поки вони не досягнуть зростання фази log (тобто вимірювання OD600 0,4-0,6 на спектрофотометрі).
  • Використовуючи OD600, отриманий з досягнутої фази журналу, розрахуйте об’єм бульйону, необхідний для отримання 2,5 х 10 9 одиниць зображення колонії (КУО) на мл. Об'єм пелету в пробірках по 50 мл при 4500 х г протягом 10 хв.
  • Викиньте супернатант і замініть гранулу в пробірці 50 мл 1x PBS для промивання клітин. Знову центрифугуйте при 4500 х г протягом 10 хв.
  • Викиньте супернатант і знову повісьте гранулу в 25 мл 5% знежиреного молока в 1х PBS.
    1. Крок перевірки: Використовуйте зразок 25 мл суспензії для проведення життєздатного підрахунку пластин для визначення кількості КУО/мл.
  • Аліквотують 25 мл ресуспендування культури знежиреного молока в 2 мл культурі в 2 мл криофайлів. Заморозити спалах у рідкому азоті та зберігати при -80 ° C принаймні протягом ночі перед використанням.

    • 9. Перевірка запасів росту та штаму, які будуть збережені для випробувань на тваринах.

    1. Для кожного сорту, що підлягає випробуванню, видаліть із заморожених запасів щонайменше 3 кріовіалу з місця зберігання -80 ° C та розморожуйте при 4 ° C протягом 2-4 годин. Якщо залишився заморожений запас, ненадовго прогрійте при температурі 37 ° C.
    2. Візьміть невеликі зразки з кожного кріовіалу для перевірки кожного сорту.
      1. Виконайте життєздатний підрахунок пластин, щоб визначити кількість КУО/мл. Нормально мати менше КУО/мл після заморожування через загибель деяких бактеріальних клітин.
      2. Використовуйте ПЛР та специфічні для розтягування праймери для перевірки кожного штаму.
      3. Проведіть пальцем кожен відбиток на селективних носіях, щоб перевірити фенотип.
    3. Переконавшись, що штами мають правильний генотип і фенотип, і перевіривши КУО/мл, перейдіть до випробувань на тваринах.

    10. Вакцинація тварин бактеріальними штамами шляхом ін’єкцій

    11. Статистичний аналіз смертності тварин

    12. Візуалізуйте інфекцію біолюмінесценцією

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Як на малюнку 2Як показано, цільова геномна делеція може бути підтверджена за допомогою ПЛР колонії зі специфічними праймерами, що посилюють область, що цікавить. Колонії, які несуть геномну делецію, призводять до більш короткого розміру смуги ПЛР порівняно з колоніями дикого типу. Екрану ПЛР з 10-12 колоній зазвичай достатньо для виявлення принаймні однієї колонії, що несе цільову делецію. Якщо стирання не виявляються після кількох раундів екрану, повторіть процес, що починається з спряження. Якщо видалення все-таки не вдається, розгортання плазміди, можливо, доведеться підтвердити секвенуванням, редизайном або фатальною послідовністю. Перевіривши делецію гена за допомогою ПЛР, підтвердьте делецію шляхом секвенування. Отриманий штам можна багаторазово піддавати процесу для отримання послідовних геномних модифікацій.

    Як на малюнку 3як показано, смертність, пов'язана з інтраперитонеальною ін'єкцією аттенуйованого штаму P. aeruginosa PGN5 (+ mucE), становила 0%, що було таким самим, як і при E. coli BL21. З іншого боку, внутрішньочеревна ін’єкція батьківського штаму (VE2) була летальною для 80% мишей. Ці результати були досягнуті великими етапами для перевірки ін'єктованих штамів. Хоча точна причина смерті у цих мишей невідома, її можна простежити, принаймні частково, до експресії факторів вірулентності у батьківському штамі, які були видалені з аттенуйованого штаму PGN5. Відмінності в прогресуванні інфекції спостерігали у батьків, мічених біолюмінесценцією, та аттенуйованих штамів. Ослаблений стебло залишався локалізованим у місці ін'єкції, поки біолюмінесценція не зів'янула (рис.4). Кліренс інфекції, швидше за все, збігся з згасанням біолюмінесценції. Біолюмінесценції не виявляли через 24 години після ін'єкції, і миші жили тижнями після ін'єкції, поки не померли без побічних ефектів.

    генів
    Рисунок 2: Гель-електрофорез продуктів ПЛР колонії з екрану делеції aroA для генерування ослабленого штаму P. aeruginosa, PGN5. Продукти ПЛР колоній, що працюють на смугах 2-5 і 8-11, показують колонії з диким типом aroA. Продукти ПЛР колоній, що працюють на смугах 6 і 7, несуть ерудацію гена ери, що позначається меншим продуктом ПЛР (жовта зірочка). Використовувані праймери спеціально посилювали геномну область, що містить ген aroA: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND та aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Очікуваний розмір продукту ПЛР у диких колоніях становив 2548 нуклеотидів (nt). Очікуваний розмір продукту ПЛР у колоніях з делецією aroA становив 307 нт. Драбина ДНК була прокладена в смугах 1 і 12. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

    генерування
    Малюнок 3: Загальна смертність мишей, інфікованих патогенним штамом P. aeruginosa (VE2), ослабленим штамом P. aeruginosa (PGN5 + mucE) та контролем FDA E. кишкова паличка (BL21). Тільки миші, яким вводили патогенний батьківський штам, мали смертність 80%. Ослаблений штам P. aeruginosa та контроль FDA E. coli штам мав летальність 0%. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

    генів
    Малюнок 4: Зображення миші через 3 год після ін’єкції аттенуйованого штаму P. aeruginosa PGN5 + mucE біолюмінесцентним маркером. Біолюмінесцентні бактерії можна було виявити до 18-24 годин після ін’єкції. Протягом цього часу біолюмінесценція залишалася в місці ін’єкції, що свідчить про те, що бактерії залишались локалізованими в місці ін’єкції. Ця миша повністю відновилася без побічних ефектів. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Плазміда pEX100T-Not1 є ефективним посередником послідовних геномних делецій, які не містять маркерів і в кадрі. При розробці штамів бактерій для ослаблення вірулентності видалення цілих генних послідовностей замість генерування точкових мутацій зменшує ймовірність повернення до вірулентного фенотипу. Крім того, кожне видалення гена патогенності додатково демпфірує патоген і підвищує стабільність демпфування.

    Цей метод також може бути використаний для створення геномних модифікацій, відмінних від делецій, таких як точкові мутації та вставки, просто змінюючи конструкцію плазмідної вставки. Такі типи модифікацій можуть бути кориснішими, ніж цілі делеції генів для технічних бактерій із модифікованим метаболізмом, наприклад. Послідовна геномна модифікація має значний потенціал для генерації дизайнерських штамів бактерій для конкретних цілей у наукових дослідженнях та промисловості. Інші методи генерування бажаних безмаркерних геномних модифікацій у бактеріях були описані 15, 16, 17, 18. Як і у всіх методах редагування геному, спроби модифікації основних областей геному можуть бути фатальними і, отже, невдалими. У цих випадках для ідентифікації штаму бактерій необхідна ідентифікація різних генетичних модифікацій або інших генів-кандидатів.

    З огляду на численні події реплікації та проходження кожної колонії в цьому протоколі, відбуватимуться ненавмисні зміни в геномі виробленого сорту. Точні геномні зміни можна визначити, встановивши послідовність всього геному. Однак наслідки цих змін важче визначити. При розробці бактерій з певною метою стерпні геномні зміни, які не впливають негативно на ріст організму або цільові шляхи. Залежно від утвореного штаму, можливо, можна визначити "показник", щоб переконатися, що сорт продовжує бути корисним за призначенням. Наприклад, за допомогою PGN5 метою було створити ослаблений штам, який зберігав би здатність продукувати велику кількість альгінату. Після видалення п’яти генів патогенності було виміряно кількість та склад альгінату, продукованого PGN5, і виявлено, що вони порівнянні з іншими штамами, що продукують альгінат. На вироблення альгінатів не впливали ні п'ять делецій гена, ні ненавмисні геномні зміни, що відбулися під час розвитку PGN5.

    Використання біолюмінесценції як маркера дозволяє додатково перевірити введені штами бактерій, оскільки маркер можна візуалізувати в місці ін'єкції. Вставка біолюмінесцентного маркера в бактеріальну хромосому необхідна для отримання біолюмінесцентних зображень, але може бути неможливою при роботі з несумісними штамами/видами. Однак маркування штамів з біолюмінесценцією не потрібно для тестування на ослаблення. Штами, протестовані в цьому дослідженні, мітили біолюмінесценцією, що дозволяло візуалізувати відмінності в локалізації між штамами протягом перебігу інфекції. Ми спостерігали, що патогенний штам поширювався по тілу миші, але непатогенний штам залишався в місці ін'єкції. Хоча цей експеримент протестував лише два дуже тісно пов'язані штами P. aeruginosage, він припускає, що поширення бактерій пов'язане з вірулентністю, принаймні у P. aeruginosa. Таким чином, цей метод мічення біолюмінесценцією може бути використаний у майбутньому для візуалізації прогресування інфекції з метою швидкої оцінки ослаблення технічних штамів бактерій.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автор Хонгвей Д. Ю. є головним науковим керівником та співзасновником компанії Progenesis Technologies, LLC.