Імплантація каротидної манжети для ініціювання атеросклерозу, викликаного напругою зсуву, у мишей
Резюме
Звужна манжета, представлена в цій статті, призначена для індукування атеросклерозу в загальній сонній артерії мишей. Завдяки конусоподібній формі внутрішнього просвіту імплантованої манжети генерує чітко визначені ділянки низького, високого напруги зсуву та коливань, що викликають розвиток атеросклеротичних уражень різних запальних фенотипів.
Анотація
Широко поширена думка, що зміни напруги судинного зсуву викликають експресію генів запалення в ендотеліальних клітинах і тим самим індукують атеросклероз (оглянуто в 1 і 2). Роль напруги на зсув широко досліджена in vitro для вивчення впливу динаміки потоку на ендотеліальні клітини в культурі 1,3,4 та in vivo у великих тварин та людей 1,5,6,7,8. Однак високовідтворювані моделі дрібних тварин, що дозволяють систематично досліджувати вплив зсувних напружень на розвиток нальоту, зустрічаються рідко. Нещодавно Нам та ін. 9 представляє модель миші, в якій перев'язка гілок сонної артерії створює область низького потоку та коливань. Хоча ця модель призводить до дисфункції ендотелію та швидкому формуванню атеросклеротичних уражень у гіперліпідемічних мишей, не можна виключати, що запальна реакція спостерігається, принаймні частково, наслідком ендотеліального та/або пошкодження судин через лігатуру.
Щоб уникнути таких обмежень, була розроблена манжета для модифікації напруги зсуву на основі розрахункової динаміки рідини у формі конуса, внутрішній просвіт якої був обраний для створення визначених областей нижчих напружень зсуву, підвищених та коливальних рівнів у загальній сонній артерії 10. Застосування цього модель у аполіпопротеїну Е (апоЕ) мишей-нокаутів, які годували дієту із високим рівнем холестерину західного типу, судинні ураження розвиваються вище і нижче за манжетою. Їх фенотип корелюється з динамікою регіональних потоків 11, що підтверджено in vivo за допомогою магнітно-резонансної томографії (МРТ) 12: низький і ламінарний зсувний стрес перед манжетою спричинює утворення обширних бляшок більш фенотипу. Вразливий, тоді як коливальний зсув нижче стрес, що манжета індукує стабільні атеросклеротичні ураження 11. У цих регіонах високого напруги зсуву та сильного ламінарного потоку всередині манжети зазвичай не спостерігається атеросклеротичних бляшок.
На закінчення, процедура модифікатора напруги зсуву манжети є надійним хірургічним підходом для отримання фенотипово різних атеросклеротичних уражень у мишей з дефіцитом ApoE.
Протокол
1. Приготуйте модифікатор напруги зсуву (манжету)
2. Імплантуйте манжету навколо правої сонної артерії
3. Експлантація манжети та сонних артерій
- Для гістологічного аналізу сонних артерій слід збирати кінець періоду спостереження. Перш ніж розпочати експлантацію, тварину слід вбити відповідно до вказівок IACUC.
- Якщо манжети потрібно використовувати повторно, обережно видаліть усі фрагменти тканин і швів, що з'єднуються з пластиковими елементами, розсікаючи сонні артерії, промийте та зберігайте напівчушки в спиртовому розчині. 70%. Слід мати на увазі, що манжета закріплюється в спайках сполучної тканини після кількох тижнів імплантації, і манжету потрібно розбирати з обережністю, щоб не нашкодити стінці судини.
- Крім того, манжету можна експлантувати та інтегрувати разом із сонною артерією. Пластик покриття стійкий до нормальних фіксуючих розчинів та розчинників, що використовуються для вкладання парафіну. Крім того, бортові зразки можна вирізати, використовуючи звичайний мікротом, оснащений звичайними лезами.
4. Репрезентативні результати
Манжету завжди слід розміщувати навколо однієї з двох загальних сонних артерій тварини (рис. 1А, 1В) - контралатеральна сторона служить контролем. На зображенні, що показує дві напівчерепинки ковпачка (рис. 1Б), видно конічну форму внутрішнього просвіту. Ця конічна форма є важливою для встановлення трьох регіонів, де динаміка протікає чітко. Типові моделі напружень зсуву, спричинених розплавом, розраховані за доплерівськими вимірами 11 та відповідні швидкості потоку на основі швидкості контрасту фази МРТ 12 наведені на малюнку 2.
Коли манжета імплантована мишам-нокаутам ApoE, що харчуються дієтою західного типу, динамічна модифікація потоку викликає зсувне напруження, викликане атероматозним відкладенням бляшок (рис. 3): Конічне ламінарне перед звуженим ламінаром веде до масового розвитку атеросклеротичних бляшок більш вразливий фенотип, що характеризується ядрами ліпідів, розташованими близько до центрального просвіту, покритого лише тонкою волокнистою стяжкою (рис. 3A1). Конічний внутрішній просвіт зап’ястя призводить до збільшення швидкості потоку. У цій області майже не спостерігається відкладення нальоту. Безпосередньо за течією місця вузького місця безпосереднє розширення артерії призводить до зони завихрень та коливальних флопараметрів w, спричиняючи розвиток менш обширних бляшок більш стабільного фенотипу (тобто ліпідних ядер, які менш локалізовані ближче до середовищ ).
Рисунок 2. Області динаміки різних потоків та зсувних напружень. Імплантація динамічного потоку манжети та напруги змінюють зсув, що слідує в сонній артерії, до звуження певним чином. У верхньому схематичному зображенні показані різні властивості потоку та наведені приблизні локальні значення напружень зсуву (на основі вимірювань Доплера 11). Нижче відповідні швидкості потоку для однієї тварини, виміряні за допомогою МРТ перед імплантованою манжетою, показані на Т1-зваженому МРТ-зображенні поперечного перерізу шиї (візуалізація контрасту фази швидкості, детальніше див. 12).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
З метою мінімізації експериментальних варіацій рекомендується працювати з тваринами майже одного віку та з однаковою історією дієти. Нещодавно опубліковане дослідження демонструє, що модифікатор напруги зсуву, застосовуваний у мишей дикого типу, може бути гарною моделлю для дослідження дисфункції ендотелію та ранніх запальних реакцій, викликаних зміною динамічного потоку 13. Однак для дослідження трансгенної гіперліпідемії атеросклеротичних бляшок моделі розвитку мишей (наприклад, нокаутовані миші ApoE) є обов’язковими. Прогресія та ступінь відкладення нальоту в кожній моделі миші залежить від типу дієти, що використовується. Загалом, чим вищий вміст холестерину/жиру в раціоні, тим швидше прогресує захворювання.
Під час імплантації манжети хірург повинен намагатися мінімізувати пошкодження тканин та маніпуляції, оскільки це зменшить запальні реакції через травму. Мінімізація травм особливо важлива, коли запальні процеси в процесі атеросклерозу є предметом дослідження. Для того, щоб оцінити ступінь післяопераційного запалення, настійно рекомендується імплантувати необв’язуючі контрольні манжети деяким тваринам. Контрольна манжета повинна бути циліндром, виготовленим з того ж матеріалу, але з постійним, не звужуючим внутрішнім діаметром.
Також важливо завжди розміщувати манжету в одному положенні сонної артерії і завжди вибирати одну і ту ж сторону, протилежні швидкості потоку не відтворюються. Хірург повинен ретельно подбати про правильність манжети, поєднавши дві оболонки з напівманжетою, оскільки погані результати збігаються в конічній формі, це непростий внутрішній просвіт, що в свою чергу призводить до непередбачуваних параметрів потоку.
Великою перевагою модифікатора напруги зсуву є те, що він створює три чітко визначені області з характерними характеристиками та відтворюваними швидкостями потоку в одному посудині (рис. 2, таблиця 1). У гіперліпідемічному середовищі кожна з цих моделей потоку спричиняє відкладення нальоту характерного фенотипу (рис. 2), що нагадує вразливі та стабільні бляшки у людей.
Таким чином, представлена каротидна манжета миші є цінною моделлю in vivo для вивчення фенотипів зубного нальоту, спричинених напругою зсуву (стабільним і нестабільним). Більше того, це також може бути ідеальною тваринною моделлю для нащадків розробки нових молекулярних візуалізаторів, призначених для виявлення місць на початку атеросклерозу ще до того, як прогресуюче відкладення нальоту призводить до стенозу або розриву нальоту, початкова подія викликає серйозні серцево-судинні події, такі як утворення тромбів та інфаркт міокарда.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Це дослідження частково фінансувалось Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), проект PI GZ 771/1-1; SFB 656 "Серцево-судинна молекулярна візуалізація", Мюнстер, Німеччина (проекти C6, Z2, B3 та PM3); UE NoE "Діагностична молекулярна візуалізація-DIMI" (WP 11.1 та 11.2). Також дослідження фінансувалося частково Британським фондом серця у Великобританії.