Комп’ютерна томографія та оптичне зображення зв’язку остеогенез-ангіогенез для оцінки інтеграції

Резюме

Імплантація аутологічних та алогенних кісткових трансплантатів є прийнятими підходами для лікування значної черепно-лицьової втрати кістки. Проте вплив складу трансплантата на взаємодію між неоваскуляризацією, диференціацією клітин та утворенням кісток очевидний. Ми представляємо мультимодальний протокол візуалізації, спрямований на з’ясування взаємозалежності ангіогенезу та остеогенезу в безпосередній близькості до трансплантата.

Анотація

3D-аналіз судин із високою роздільною здатністю продемонстрував значно більший ангіогенез у тварин з імплантованими аутотрансплантатами, особливо щодо формування артеріол. Як результат, перфузія крові була значно вищою в групі аутотрансплантатів на 7-й день після операції. Ми спостерігали чудову мінералізацію кісток і більшою мірою формування кісток у тварин, які отримували аутотрансплантати. Аутологічна імплантація резидентів індукує рекрутування стовбурових клітин у шві кісткового трансплантата-хазяїна, де клітини диференціюються в кісткові клітини, утворюючись між 7-м та 10-м післяопераційним днем. Цей висновок означає, що посилене формування кісток можна пояснити збільшенням судинного запасу, що характеризує імплантацію аутотрансплантата. Розкриті методи можуть слугувати оптимальним інструментом для вивчення регенерації кісток з точки зору чітко відмежованого формування кістки та неоваскуляризації.

Вступ

Втрата черепно-лицьової кістки внаслідок травми, резекції пухлини, декомпресійної краніотомії та вродженого дефекту рідко заживає самостійно і представляє явну незадоволену клінічну потребу. Аутологічні кісткові трансплантати та алогенні кісткові трансплантати широко використовуються для лікування цих станів 1.

Поширена думка, що остеогенез тісно пов'язаний з ангіогенезом 2,3. Таким чином, повне вивчення запропонованої терапії для регенерації кісток повинно включати ретельне дослідження утворюючого судинного дерева через всю ділянку дефекту. Існує кілька методів, що характеризують судинність у моделях дослідження. Судинне дерево можна вивчити за допомогою гістологічного аналізу. Оскільки гістологія спирається на тканину, що розділяє, існує велика ймовірність, що отримане зображення буде спотворене. Для вирішення цієї проблеми можна провести інтравітальну мікроскопію непошкоджених судин на малюнку 4; однак цей метод обмежений площинною візуалізацією. Сканування μCT зразків, отриманих від тварини, перфузованої контрастною речовиною, дозволяє тривимірно зобразити судинну мережу, що забезпечує місце регенерації 5. Цей підхід дозволяє дуже детально продемонструвати судинну систему органу в цілому, а також ретельний аналіз розподілу кровоносних судин. Крім того, μCT дозволяє диференціювати різні діаметри судин, що характеризують різні підтипи судин.

Ми припускаємо, що імплантація черепного аутотрансплантата призведе до більшої неоваскуляризації, ніж імплантація алотрансплантата, і ця посилена неоваскуляризація, в свою чергу, призведе до поліпшення формування кісток. Ми використовували різні методи. Ми дослідили закономірності новоутвореного судинного дерева, виконавши порівняльний аналіз μCT. Ми вимірювали перфузію крові за допомогою флуоресцентного зонда з пулу крові. Далі ми оцінили мінералізацію кісткової тканини методом FLI спрямованого зонду гідроксиапатиту та аналізу μCT. Нарешті, ми прослідкували набір та диференціацію стовбурових клітин для проведення BLI у трансгенних мишей, у яких люцифераза експресується в остеокальцинових позитивних клітинах.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Протокол відповідає керівним принципам Комітету з догляду за тваринами та використання (IACUC) Єврейського університету в Єрусалимі, Ізраїль, затвердженої установою AAALAC (заявка № MD-12-13524-4) та Медичного центру Кедар-Сінай IACUC (Заява No 3770). З тваринами обробляли суворо відповідно до вказівок NIH.

1. Приготування алотрансплантатів

2. Невдала операція на черепі

оптичне
Рисунок 1. Підготовка та хірургія черепно-мозкового дефекту аллотрансплантата. Кістковий фрагмент виділений з області черепа (AT). М'який хустку, кістковий мозок і кров змазують (B), і трансплантат промивають 70% етанолом, після чого проводять два промивання сольовим розчином, забуференним фосфатом (VS, GA = алотрансплантат). Миша-реципієнт готується до операції шляхом гоління та дезінфекції шкіри в області черепа (D). У шкірі шкіри голови створюється овальний виріз, а окістя видаляється (E). Потім черепний дефект свердлять за допомогою трефіну діаметром 5 мм (F). Кістковий фрагмент відокремлюється ложкоподібним шпателем, залишаючи верхній сагітальний синус цілим (G). Потім алотрансплантат поміщають у дефект і закріплюють за допомогою фібринового гелю (H). Нарешті, шкіру зашивають (I). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

3. Мікрокомп’ютерна томографія для характеристики судинного дерева

4.Флюоресцентне зображення мінералізації кісток та перфузії крові

5. Мікро-комп’ютерна томографія для регенерації кісток

  1. Для кількісного визначення утворення кісток знеболюйте мишей, вдихаючи 3% ізофлурану, як показано на кроках 4.2 - 4.3. Перенесіть мишу на скло сканера μCT і помістіть її в сканер.
  2. Встановіть потенційну енергію рентгенівської трубки сканера μCT на 55 кВ та інтенсивність 145 пА при середній роздільній здатності. Використовуючи поле зору 20,5 мм, виконайте скаутське (просте рентгенівське) сканування та визначте область, що цікавить, що охоплює очі миші в задній частині черепа. Виконайте КТ, використовуючи 1000 проекцій на 360 ° та час інтеграції 200 мс.
  3. Відновіть 2D фрагменти, використовуючи номінальну просторову роздільну здатність 20 мкм. Вирівняйте поля дефектів до стандартизованого положення за допомогою програмного забезпечення μCT 9.
  4. Подібно до кроку 3.20, визначте циліндричний об'єм, що нас цікавить, і застосуйте обмежений 3D-гауссовий фільтр (σ = 0,8 та опора = 1) для часткового видалення шуму в обсягах. Відрізок кісткової тканини з м’яких тканин за допомогою комплексної порогової процедури.
  5. Визначте об’єм мінералізованої кісткової тканини в об’ємі, що нас цікавить.

6. Візуалізація стовбурових клітин та їх диференціація за допомогою біолюмінесценції

  1. Підготуйте мишу до візуалізації, як описано в розділах 4.2-4.4, і пробудіть мишей, вдихаючи 100% кисень.
  2. Введіть 126 мг/кг люциферину жука кожній миші шляхом внутрішньочеревної ін’єкції та поверніть тварину в індукційну камеру. Через 2 хв анестезуйте тварину, використовуючи 3% ізофлуран. Наведіть курсор миші на нагрітий етап IVIS.
  3. За допомогою програмного забезпечення Live Image встановіть для часу експозиції значення "авто", а для поля зору - зображення C. миші через 5 хвилин після введення люциферину. Зобразіть тварин, як показано на кроці 4.6, використовуючи спосіб «біолюмінесценції» для визначення цікавих областей, оскільки експресія трансгену різниться у мишей. Нормалізуйте черепний сигнал до хвоста.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Малюнок 3. за замовчуванням імплантація аутотрансплантату полегшує ангіогенез. Черепні були створені на мишах. Половина тварин отримала алотрансплантати, а інша половина - аутотрансплантати. Мишей перфузували полімеризаційним контрастним речовиною через 7 днів після операції. Черепну область було виділено, а зразки пом’якшені та зображені за допомогою сканера μCT. Об'ємна карта товщини була створена за допомогою програмного забезпечення IPL (AT, n = 3, стовпчики представляють ± SE, а зірочки означають значення P Необхідна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Важливим етапом в описаних протоколах є визначення місця дефекту (етап 2.7). Травма лямбдоїдного шва призведе до масивного крововиливу. При свердлінні черепно-мозкової патології слід дотримуватися обережності, щоб не порушити нижню тверду мозкову оболонку та верхню поздовжню пазуху. Нарешті, введення голки крила в лівий шлуночок є делікатною процедурою (крок 3.4). Якщо голку ввести в правий шлуночок, контрастна речовина буде перфузувати легені і проходити до вен, що призведе до поганої перфузії склепіння черепа. Якщо голку ввести занадто глибоко, вона проколить задню стінку серця; а якщо голку ввести недостатньо далеко, вона може легко вирвати серце. Не намагайтеся відрегулювати положення голки, оскільки це може заважати інфузії. Метод може бути модифікований за допомогою набору доступних флуоресцентних зондів; Integrin α-β 3v-націлений зонд може бути використаний для напруження новоутворених судин, тоді як зонд-катепсин, націлений на K, може бути використаний для кількісної оцінки активності остеокластів.

Відповідно до нашої гіпотези, ми спостерігали, що черепні аутотрансплантати мають вищий остеогенний потенціал, ніж аллотрансплантати. Це стосується і довгих кісток 13, і це можна пояснити кількома факторами. По-перше, аутотрансплантатна кістка містить клітини, що утворюють матрикс, які виробляють кістку через поверхню трансплантата, як показано на мінералізації, спрямованій на FLI (рисунок 4А); тоді як алотрансплантати викликають рідкісне утворення кісток лише на межі дефектів. По-друге, остеокальцино-люковий мишачий BLI виявив більшу остеогенну активність у групі аутотрансплантата, що можна пояснити наявністю факторів росту, які видаляються в процесі підготовки алотрансплантата. (малюнок 4F). Цікаво, що мінералізація кісток була значно вищою на 6 і 7 день, коли вводили цільовий зонд гідроксиапатиту, а диференціація клітин, представлена ​​активністю BLI, виявилася пізніше, між 7 і 10 днями. Ми можемо зробити висновок, що більш широка мінералізація кісток може бути щонайменше частково пояснюється сприятливою судинною системою, яка характеризує аутологічну трансплантацію кісток.

Наші результати вказують на те, що аутотрансплантат має чудову остеогенну здатність; однак слід брати до уваги, що аутогенний кістковий трансплантат має кілька ЗНИЖКІВ. Урожай кісток обмежений за обсягом і призводить до захворюваності на місці донора 14-16. Крім того, частота резорбції аутотрансплантованої кістки не є незначною 17-19. Алотрансплантати є високодоступними та представляють собою готове рішення для клініциста. Багато робіт підкреслювало, як остеоінтеграцію алотрансплантатів черепа можна покращити різними способами, починаючи від покриття алотрансплантата BMP2, що кодує аденоасоційований вірус, і закінчуючи 20,21 ад’ювантним лікуванням, таким як переривчаста паратиреоїдна терапія 22. Зрештою, як тільки здатність алогенного трансплантата злитися з кісткою стане досконалою, алогенний стане найкращим матеріалом для трансплантації.

У світлі цих результатів особливий інтерес представляє питання про те, як модулювати неоваскуляризацію в місці регенерації кісток. Прямий підхід до надмірної експресії VEGF виявився неефективним, оскільки утворюючі кровоносні судини є негерметичними та не утворюють функціональної мережі 23,24. Цікаво, що встановлено, що передача сигналу BMP призводить до цілеспрямованого формування кровоносної судини 25,26. Крім того, було показано, що фармацевтичні агенти 11 та клітинна терапія 27 модифікують схеми ангіогенезу при сусідньому пересадці кісток; представлені два перспективні стратегічні підходи для покращення загоєння дефекту черепної кістки.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.