Кон’югована лінолева кислота Cis-9, trans-11 пригнічує запальні процеси на моделях астми in vitro та в

1 З ІНСТИТУТУ ДО ХАРЧОВИХ НАУК ФРІДРІХ-ШИЛЛЕР-УНІВЕРСИТЕТ ДЖЕНА ЛЕРШТУЛЬ ПИТАННЯ ФІЗІОЛОГІЯ Цис-9, кон'югована лінолева кислота, транс-11, пригнічує запальні процеси в моделях астми in vitro та in vivo Дисертація Фармацевтичний факультет Університету Фрідріха Шиллера в Єні, автор Анке Магдалена Яудсус з Мехтерштетської Єни, 2008

2 рецензенти: 1. Проф. Д-р. Герхард Яхрейс 2. Проф. Стефан Лорковський 3. Проф. Д-р. Лікар. Альфонсо Лампи Дата суперечки: 26 лютого 2009 р

3 Мої батьки Аннемарі та Дітмар та всі діти, які навчаються в CLA

4 ЗМІСТ Список скорочень V Список малюнків VII Список таблиць IX 1 Вступ Визначення бронхіальної астми та епідеміологія Діагностика Патофізіологія Імунологічні основи Причини алергічної сенсибілізації Причини алергічної реакції та фактори ризику Генетика Фактори навколишнього середовища Інфекції та гіпотеза гіпотези Гіпотеза Гіпотеза Гіпотеза Гіпотеза Дієта Синтез CLA Бактеріальні хімічні фізіологічні ефекти Рецептори, активовані проліфератором пероксисоми (PPAR) Члени сімейства PPAR Структура Контроль експресії генів PPARs та запалення дихальних шляхів CLA розвиває протизапальні ефекти за допомогою PPARs Об'єктивна гіпотеза Спеціальна мета Частина I: Імунологія Модель in vitro Модель in vivo Частина II: Метаболізм Матеріал та методи Модель in vitro Біологічні методи клітин Стимулятори та інгібітори Жирні кислоти Антагоніст PPARγ GW ліпополісахарид The Z elllinie BEAS-2B культивування тривале зберігання стимуляція BEAS-2B виділення та очищення еозинофілів проточної цитометрії спільна культура BEAS-2B та еозинофілів I.

7 ЗМІСТ 9.4 Включення c9, t11-cla в BEAS-2B через 24 години виявлення t7, c9- і t8, c10-cla у піку c9, t11-cla Доповнена олія: c9, багате на t11-cla триазилгліцерин: CLA-Mix Triazylglycerol Розподіл жирних кислот після дієти, багатої оливковою олією Декларація Подяки Публікації та внески до конференції CV IV

28 ВСТУП (Chin et al. 1994). Однак, оскільки більшість досліджень проводили із сумішами ізомерів, які містили c9, t11-cla та t10, c12-cla приблизно в рівних частинах та невеликі кількості інших ізомерів, спостережувані ефекти не можна було чітко віднести до того чи іншого ізомеру. Удосконалені методи синтезу для представлення окремих ізомерів тепер дозволяють набагато більш диференційовано зрозуміти цілком різні, а часом і суперечливі способи дії c9, t11-cla та t10, c12-cla (табл. 2 і 3). 16

48 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ Виявлення: Ферментний реагент: Вторинне антитіло: біотинільований анти-людський IL-8 mAb (клон G 265-8, BD Pharmingen): 1 мкг/мл у блокувальному буфері Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 у блокувальному буфері Реагент субстрату: ТМВ 1: 100 у буфері Галлаті ТМБ: 240 мг 3,3,5,5 -ТМБ (Fluka, Neu-Ulm, D) 5 мл ДМСО (Sigma) 5 мл етанолу Буфер Галлаті: Цитратний буфер: Зупиніть Розчин: 0,034% H 2 O 2 (Merck) у цитратному буфері, 33,6 г моногідрату лимонної кислоти в 400 мл дистильованої води. розчинити 4 н. КОН довести до pH 3,95 дистильованою водою. до 500 мл 1 M H 3 PO 4 (всі Merck) ELISA для кількісного визначення ECP ELISA для виявлення ECP проводили за допомогою комерційно доступного набору (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) відповідно до рекомендацій виробника. 96 мікропланшетів, що входять до комплекту, вже були покриті покриттям, і розчини були готові до використання або готувались відповідно до інструкцій. Межа виявлення цього набору становила 0,125 нг/мл. 36

49 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ. Модель in vivo Жіночий BALB/c був отриманий від Harlan Winkelmann (Borchen, D) та мав 6-8 тижнів, коли їх приймали. Усі експерименти були схвалені Державним управлінням охорони праці, охорони здоров'я та технічної безпеки Берліна (LAGetSi) як продовження існуючої програми експериментів на тваринах (Reg G 0247/03) відповідно до німецького Закону про захист тварин. 3.4 Підживлені кормом олії CLA, багатий т11-CLA триазилгліцерином (табл. 6, рис. 13) проводили за допомогою методу перетворення метилрициноляту () та препарату CLA-Mix (табл. 6, рис. 13) Каталізована базою ізомеризація лінолевої кислоти, виробленої на основі сафлорової олії (обидва Cognis, Illertissen, D). Таблиця 6: Склад жирних кислот препаратів CLA. Аналіз ГХ. Жирна кислота [% FSME] c9, t11-прозора суміш TAG CLA TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Інше 6.7 1.4 Скорочення: метиловий ефір жирної кислоти TBE, триазилгліцерин TAG 37

50 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ A c9, багатий на t11 ДН B Вміст CLA ДЕНЬ 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45,0% 52,6% 74,9% Рис.13: Розподіл ізомерів препаратів CLA. A: c9, t11-cla-багатий TAG. B: CLA-Mix DAY. Показано відсоток від загальної кількості CLA. ВЕРХ-аналіз (9.5) Режим годівлі Після 5 днів адаптації до умов утримання (22 С, 12-годинний цикл світло/темрява, макс. 5 тварин/клітка в системі полиць IVC), тварин випадковим чином розподіляли до досліджуваних груп. Випробувальні дієти базувались на підтримуючій дієті V1535 від сніфф (Соест, D) і являли собою спеціальні замовлення, збагачені відповідними оліями (табл. 7). Таблиця 7: Склад жирних кислот досліджуваних дієт [г/кг]. Основний контроль корму Первинний контроль профілактики Вторинний запобігання c9, t11- CLA CLA-Mix жирна кислота Додана олія 1,5% соняшникової олії d, 3% оливкової олії d, 5% соняшникової олії 1,5% c9, t11-прозора TAG C14: 0 0,1 0, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 C18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5.0 c9, c11-cla, 9 0.1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2.3 2.5 2.4 2.5 2.5 2.3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 C20: 4n Інше 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 1,3% CLA-Mix ДЕНЬ 38

56 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ Таблиця 9: Праймери та зонди, що використовуються для ампліфікації PPARγ. Праймер генної нуклеотидної послідовності FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ праймер RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 зонд 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 там праймер FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 ß-актиновий праймер RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 зонд 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 там 10 мкл шаблону (100 нг) становили 40 мкл оптимізованої реакційної суміші піпетують (табл. 8) та аналізують у трьох примірниках на оптичних 96-лункових планшетах (ABgene, Epsom, Великобританія) в системі ПЛР у реальному часі (Applied Biosystems), використовуючи таку температурну програму: Таблиця 10: Температурна програма для ампліфікації PPARγ. Температура [С] Часові цикли хв хв с 60 1 хв 40 Рядок розведення загальної РНК, витягнутої з клітин LA-4, включався як внутрішній стандарт при кожному циклі Біохімічні методи білка ІФА для визначення IL-5 в БАЛ. Виконання ІФА: Склад розчинів: Покриття: Первинне антитіло: IL-5 mAb проти миші (клон TRFK5, BD Pharmingen): 2 мкг/мл у буфері для покриття Буфер для покриття: 8,4 г NaHCO 3, в 1 л дистильованої води . розчинити, довести рН до 8,2 10 N NaOH Промивний буфер: 0,05% Твін 20 у PBS 44

62 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ANOVA). Оскільки для цього параметра можна було інтерпретувати лише основні ефекти дієт, відмінності між групами визначали за допомогою непарних Т-критеріїв Стьюдента. Криві P enh оцінювали за допомогою ANOVA для повторних вимірювань. Порівняння груп O9 c9, t11-cla з GW9662 та без нього, а також даних підходу вторинної профілактики та концентрацій жирних кислот у тканинах проводили за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA). Вплив дієт на жирнокислотний склад досліджуваних органів оцінювали за допомогою кореляційного аналізу. Поріг значущості був встановлений з імовірністю помилки 5% (р 0,05). 50