Лептин впливає на оборот клітин епітеліальних клітин у кореляції з експресією рецепторів лептину

• реферат
• Головна
• МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
• Тварини.
• Експериментальний дизайн.
• Хірургічна процедура.
• Параметри регулювання кишечника.
• Гістологічне дослідження.
• Мікродісекція лазерного захоплення та підготовка РНК.
• RT-PCR.
• ПЛР у режимі реального часу.
• Проліферація клітин крипти та апоптоз ентероцитів.
• Експресія генів Bax та Bcl-2.
• Статистичний аналіз.
• РЕЗУЛЬТАТИ
• Параметри регулювання кишечника.
• Проліферація ентероцитів та апоптоз в тонкій кишці.
• Довга форма експресії LEPr та обмін ентероцитів у клубових склепах.
• Довга форма експресії LEPr та апоптоз ентероцитів у ворсинах клубової кишки.
• Експресія генів, пов’язаних з апоптозом.
• ОБГОВОРЕННЯ
• глосарій

реферат

Широкі дослідження на різних експериментальних моделях синдрому короткої кишки (СРС) показали, що апоптоз ентероцитів відіграє вирішальну роль в адаптації кишечника після резекції (1, 2). Незважаючи на необхідність гіперплазії кишечника, мітотичні подразники не можуть придушити запрограмовану загибель клітин (3). Багато дослідників описали посилений апоптоз ентероцитів як механізм, який компенсує посилену проліферацію ентероцитів для досягнення нової гомеостатичної швидкості під час корекції кишечника (4). Підвищений апоптоз сприяє утилізації генетично відхилених стовбурових клітин і запобігає розвитку пухлини (3, 4).

Адаптація кишечника після резекції кишечника призводить до посиленої проліферації епітеліальних клітин кишечника, а також до збільшення запрограмованої загибелі клітин, що свідчить про прискорений клітинний оборот. Результат цих дій допомагає переформувати структури ворсинків склепу у більш витягнуті та функціонально більш активні одиниці. Регулювання балансу між клітинною продукцією та втратою клітин через апоптоз після резекції кишечника є складним, і точні фактори, що керують цим процесом адаптації, залишаються незрозумілими (11, 12). Зокрема, незрозуміло, де багато з цих трофічних факторів діють уздовж осі крипта-ворсинки. Недавні результати показують, що різні фактори росту, такі як фактор росту кератиноцитів (13) та фактор росту епідерми (14), по-різному виражаються вздовж осі крипта-ворсинки. Це говорить про те, що різні трофічні фактори можуть діяти в різних місцях вздовж цієї осі. Нещодавно ми показали, що TGF-альфа (TGF-α) імітує обмін ентероцитів відповідно до експресії рецептора епідермального фактора росту вздовж осі крипти ворсин (15).

Продукт білка гена з ожирінням лептин (LEP) виводиться з адипоцитів і діє переважно на гіпоталамус, який регулює витрати енергії, споживання їжі та масу тіла (16). Хоча кишечник не є класичною тканиною-мішенню для ЛЕП, великі дослідження на різних експериментальних моделях показали, що ЛЕП визначає важливі фізіологічні ефекти на ріст кишечника, дозрівання та диференціацію клітин (17, 18). У нашій попередній роботі ми показали, що ЛЕП стимулює адаптацію кишечника після масивної резекції тонкої кишки у щурів (19). Однак про механізми цього позитивного ефекту відомо мало.

Метою даного дослідження було дослідити вплив LEP на обмін ентероцитів (проліферацію та апоптоз) у зв'язку з експресією рецептора LEP (LEPr) вздовж осі ворсин-крипти після масивної резекції тонкої кишки у щурів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Тварини.

Інституційний комітет з догляду за тваринами та використання медичної школи Раппопорта (Техніон, Хайфа, Ізраїль) затвердив обладнання та протоколи для тварин. Самців дорослих щурів Спрег-Доулі вагою від 240 до 260 г утримували в окремих клітках з нержавіючої сталі при постійній температурі та вологості та підтримували 12-годинний цикл світло-темрява. Щурів голодували із вільним доступом до води протягом 12 годин до експерименту. Загальну анестезію розпочали кетаміном (ip 90 мг/кг) та ксилазином (ip 15 мг/кг).

Експериментальний дизайн.

40 щурів були випадковим чином віднесені до однієї з трьох груп: група А, підставних щурів піддавали трансекції кишечника (бутафорські, n = 14); Група В, тварини СБС перенесли резекцію кишечника (СБС, n = 13); та групи C, щурам SBS-LEP провели резекцію кишечника (SBS-LEP, n = 13) і обробляли LEP у дозі ip 50 мг/кг від d 4 до d 14.

Хірургічна процедура.

Щурам була проведена одна з двох хірургічних процедур: трансекція кишечника з подальшим реанастомозом або 75% резекція кишечника. За допомогою стерильних методів живіт розкривали за допомогою розрізу по середній лінії. У підставних щурів середній тонкий кишечник був розірваний і зібраний знову без резекції кишечника. 75% резекція середньої тонкої кишки, подібна до описаної раніше, була проведена у тварин з СРС. Це складалося з резекції кишки між 5 см дистальніше зв’язки фон Трейца та 10 см проксимальніше ілеоцекального клапана. Безперервність кишечника відновлювали наскрізним анастомозом, використовуючи розсмоктувальні шви 6-0 (Vicryl, Ethicon Corporation, США). В усіх операціях черевна порожнина закривалась у два шари поточним швом 3/0 Vicryl (Ethicon Corporation, США). Післяопераційним щурам дозволяли вільну воду та рідку дієту. Щурів забивали на 15 день шляхом внутрішньовенного введення пентобарбіталу (75 мг/кг).

Параметри регулювання кишечника.

Тонку кишку швидко видаляли, промивали холодним ізотонічним сольовим розчином і ділили на два сегменти: тонку кишку, проксимальну до анастомозу і кінцеву клубову кишку. Товсту кишку розколювали на антимезентеріальному кордоні, промивали холодним сольовим розчином, сушили і зважували кожен сегмент. Слизову оболонку зішкребали з підлеглої тканини шпателем (Sigma Chemical Co., Ізраїль). Зразки слизової оболонки гомогенізували реактивом TRIzol. ДНК і білок витягували методом Хомчинського (20) і виражали у мікрограмах на сантиметр кишечника на 100 грам маси тіла.

Гістологічне дослідження.

Гістологічні зрізи були зроблені з проксимальної частини тонкої кишки, дистальної частини клубової кишки та порівнянних ділянок у контрольних тварин. Сегменти тонкої кишки фіксували у 10% формаліні протягом 24 годин і переробляли у стандартні парафінові блоки. П'ять мікронних зрізів тканини фарбували гематоксиліном та еозином. Висоту ворсин та глибину крипти вимірювали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Image Pro Plus 4 (Media Cybernetics, Балтимор, штат Медіка). Вимірювали десять ворсинок та крипт у кожному зрізі та реєстрували середнє значення в мікрометрах.

Мікродісекція лазерного захоплення та підготовка РНК.

Секції товщиною 15 мікрометрів встановлювали на спеціальних предметних стеклах, покритих мембраною, не оброблених РНКазою та УФ (PALM Technologies, Бернрід, Німеччина), і негайно фіксували в холодному льоду 70% етанолі на 2 хвилини. Після інкубації протягом 60 с в 1% крезилфіолетовому ацетаті зрізи зневоднювали етаноловою серією (70 і 100% на льоду) і давали коротко просушитись на повітрі. Слайди зберігали при -80 ° C до мікродисекції. Зрізи вирізали лазером протягом 3 днів. Слайди спостерігали за допомогою перевернутого лазерного мікроскопа Zeiss Axiovert 200 M та візуалізували на моніторі за допомогою програмного забезпечення PALM Robo. Кінчики ворсинок, бічні ворсинки та склепи відокремлювали за допомогою лазера. РНК екстрагували за допомогою мікронабору RNeasy (Qiagen) та протоколу мікродисекції. Всі зразки зберігали при -80 ° C для тривалого зберігання.

RT-PCR.

Якість РНК оцінювали за допомогою автоматизованої системи електрофорезу Experion (BioRad). П'ять мікрограмів РНК реверсували в кДНК при 37 ° C з використанням 200 мкМ дезоксинуклеотидів (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Місури), 5 мкМ випадкових гексамерів (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) транскрипція) та 200 од/мкл вірусу зворотної транскриптази вірусу лейкемії миші Молоні (US Biochemicals, Cleveland, OH). Налаштування термоциклера були оптимізовані для забезпечення того, щоб продукція знаходилась у фазі лінійного виробництва.

ПЛР у режимі реального часу.

Експресія довгої форми рівнів LEPr визначалася кількісною ПЛР у реальному часі на зразках кДНК з використанням набору для аналізу TaqMan на замовлення (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (барвник ROX) від ABgene, Epsom, UK) ABI-PRISM 7000 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Одиночні екзонні праймери (від PrimerDesing Ltd, Великобританія) з інтервалом 3'UTR-1064 bp (сенсовий праймер, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; антисмисловий праймер, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) були розроблені для отримання амплікону з 109 bp. 18S (5'AGGAATTGACGGAAGGGCC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) був використаний для доступу до однакового навантаження кДНК для кожного відділення. Праймери специфічні для довгої форми LEPr і не знаходяться в одному екзоні; В іншому випадку ампліфікацію забруднюючої ДНК неможливо відрізнити від ампліфікації кДНК.

Проліферація клітин крипти та апоптоз ентероцитів.

Щурам вводили стандартний реагент для мічення 5-бромдезоксиуридину (5-BrdU) (Zymed Lab, Inc, CA) у дозі 1 мл на 100 г маси тіла за 2 години до жертви. Зрізи тканин (5 мкм) депарафінізовували ксилолом, регідратували градуйованим спиртом і фарбували біотинільованою системою моноклональних антитіл до BrdU за допомогою набору для фарбування BrdU (Zymed Lab, Inc, CA). Індекс проліферації визначали як співвідношення клітин крипти, які фарбували позитивним вмістом BrdU на 10 крипт.

Додаткові 5? Зрізи були товщиною м для визначення ступеня апоптозу ентероцитів. Імуногістохімію для каспази-3 (розщепленого каспазою-3 концентрованого поліклонального антитіла; розведення 1: 100; Biocare Medical, Walnut Creek, CA) проводили для націлювання на апоптотичні клітини, використовуючи комбінацію стрептовідин-біотин-пероксидазного методу згідно з протоколами Визначте виробника. Експресія апоптозу клітин епітелію виражається як загальна кількість апоптотичних клітин вздовж цієї осі на 10 ворсинок і 100 крипт. У деяких випадках більш детальний аналіз локалізації апоптозу проводили із застосуванням раніше встановлених методик (21). З цією метою апоптоз вздовж ворсинок диференціювали між нижньою третиною ворсинок (бічні ворсинки) та верхньою третиною ворсинок (кінчики ворсинок). Апоптоз реєстрували як кількість апоптотичних клітин на 10 ворсинок. Кваліфікований патологоанатом, сліпий до джерела кишкової тканини, зробив усі виміри.

Експресія генів Bax та Bcl-2.

Загальну РНК виділяли із заморожених зразків слизової оболонки (проксимальна частина товстої кишки та дистальна клубова кишка) за допомогою реагенту TRIzol (GIBCO BRL, США), як описано Хомчинським (20). Частина загальної РНК (2 мкг в загальному обсязі 25 мкл) була зворотна за допомогою набору синтезу кДНК першого ланцюга вірусу мишачого лейкозу (MMLV) (Gene Choice, Inc. Frederick, MD) транскрибується. Після ПЛР ампліфікований продукт (5 мкл) пропускали на 2% агарозному гелі, забарвленому бромідом етидію, і фотографували. Рівень експресії гена Bax та Bcl-2 виражали як відношення щільності сірого цільового гена до щільності сірого 18S у денситометрії. Послідовності для конкретних генів були наступними: Bax 5 'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, 3'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, Bcl-2 5'TGAGGCCCTGTCTGCTTCTG, 3'AGGCTCCCGGGGCAGTCATGA (всі концентрації хімічних речовин Dag з AGS). Коли експресується більшість мРНК, праймери 18S рРНК розбавляються 1:10, щоб продукти RT-PCR потрапляли в той самий експоненціальний діапазон ампліфікації.

Статистичний аналіз.

Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Для статистичного аналізу із значенням р був використаний односторонній тест ANOVA, за яким слідував пост-спеціальний тест Бонферроні

Взаємозв'язок між експресією мРНК рецептора лептину (B) та проліферацією ентероцитів (A) та апоптозом (C) у криптах після масивної резекції тонкої кишки та лікування лептином. Значення є середніми ± SEM. Збільшення 1: 100. * с

Вплив резекції кишечника та лікування лептином на апоптоз ентероцитів (В) у кореляції з експресією рецептора лептину (А) у кінчиках ворсинок та у бічних ворсинках. Значення є середніми ± SEM. Збільшення 1: 100. * с

Вплив резекції кишечника та лікування лептином на експресію Bax та Bcl-2 у зразках слизової оболонки клубової кишки. Значення є середніми ± SEM. * стор. Морфологічні зміни включають подовження ворсинок і поглиблення крипт, посилення проліферації ентероцитів та посилення міграції ентероцитів уздовж ворсин. Функціональна адаптація призводить до збільшення поглинання поживних речовин ізольованими ентероцитами (21–23).

Основна вада дослідження полягає в тому, що аналізуються лише рівні мРНК довгої форми LEPr. Потрібні подальші експерименти, щоб оцінити експресію інших форм LEPr, які, як відомо, існують у різних тканинах щурів.

Таким чином, лікування ЛЕП стимулює ріст кишечника на моделях СРС у щурів. Підвищена експресія мРНК LEPr вздовж осі ворсинкової крипти може свідчити про відповідну роль LEP у модуляції апоптозу ентероцитів у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту. Вплив LEP на оборот ентероцитів сильно корелює з довгою формою експресії LEPr вздовж осі ворсинкової крипти.

---