МЕХАНІЗМИ І МОДАЛІТІЇ РІДКОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

6-РІДКА ХРОМАТОГРАФІЯ/МЕХАНІЗМИ І МОДАЛІТИ

Хроматограф складається з кількох частин. Центральний елемент представлений колоною, яка здійснює поділ різних сполук. Однак цей життєво важливий елемент становить лише 1-2% від ціни на всю систему.

Ця система включає:

- вище за течією 1 або більше насосів та інжектор
- нижче за течією 1 або більше детекторів (універсальних або специфічних)

Тому існує безліч варіантів, адаптованих до потреб (або бюджету) користувачів:

- так звані системи ізократичний або навпаки здатні до формування градієнти розчинники (це буде розглянуто далі)
- дуже мінливі детектори, більш-менш чутливі, більш-менш специфічні, більш-менш складні. У цій галузі вибір дуже широкий, але насправді більшість користувачів мають УФ-детектори або спектрофотометри (УФ або УФ-ВІС). Серед складних детекторів можна пам’ятати:

+ діодні детектори масиву (безперервне вимірювання довжини хвилі)
+ детектори радіоактивності безперервного потоку
+ мас-спектрометри, ЯМР-спектрометри

Детектор

використання

Межа виявлення

Лінійність

Рефрактометр

Близько 700 нг/мл

УФ (254 нм)

Близько 0,3 нг/мл

Спектро УФ-ВІС

Близько 0,3 нг/мл

Приблизно 0,008 нг/мл

Електрохімічна

Приблизно 0,001 нг/мл

Кондуктиметричний

Вибірковий (іони)

Різниця до 0,2%
провідність між 2 речовинами

Післяколонний реактор

див. УФ або флуоресценція

Мас-спектрометр

Змінюється за складом

Радіоактивність

Метаболічні аналізи

Змінюється відповідно до ізотопів

Області застосування рідинної хроматографії дуже різноманітні, і ця техніка являє собою дуже широко використовуваний інструмент, який використовується для поділу мінеральних іонів, малих органічних молекул, а також макромолекул (білків, полінуклеотидів, органічних полімерів). Для кожної категорії речовин існує один або кілька придатних хроматографічних режимів. Кожен вирішує, який із них найкраще підходить для роботи, яку хоче зробити !

Є насправді прості загальні правила, які дозволяють обґрунтовано вибирати відповідний хроматографічний режим; вони базуються на таких параметрах, як розмір, полярність та заряд сполук, що підлягають аналізу.

Продуктивність 6-1-стовпця

Продуктивність стовпців виражається як функція двох основних параметрів:

? КІЛЬКІСТЬ ТЕОРЕТИЧНИХ ПЛАТФОРМ = ЕФЕКТИВНІСТЬ (це виражає тонкість піків сполук, що залишають колони)
? СЕЛЕКТИВНІСТЬ = здатність системи, яка використовується для розрізнення, отже, для відокремлення введених сполук.
Щоб поділ був ефективним (= ВИСОКА РОЗДІЛЬНА ЗДАТНІСТЬ ) звичайно необхідно одночасно оптимізувати два попередні параметри.

ЕФЕКТИВНІСТЬ: N

Це виражається як кількість теоретичних пластин (N), цифра, розрахована на основі часу утримання (tr) та ширини піку (w) або ширини піка в середині висоти (w1/2) відповідно до рівняння:

N = 16 (tr/w) 2 = 5,54 (tr/w1/2) 2
Кількість лотків для поточних колон (заповнених частинками діаметром 5 мкм) становить від 80000 до 100000 на метр або від 20 до 25000 для колони довжиною 25 см (стандартна довжина).

Можна розрахувати кількість ефективних пластин (N '), отриманих шляхом заміни в попередніх рівняннях часу утримання tr на зменшений час утримання t'r = (tr - до); звичайно N 'є коефіцієнтом симетрії відношенням a/b напівширини при 10% загальної висоти піку: в принципі ми маємо 0,85 СЕЛЕКТИВНІСТЬ:
Щоб розрахувати цей коефіцієнт, спочатку потрібно визначити перший параметр, коефіцієнт ємності k ':

[Н.Б.: коефіцієнт ємності k 'легко віднести до Rf отримані тонким шаром, і ми можемо легко продемонструвати, що k '= (1/Rf ) - 1.

Це дозволяє транспортувати результати з ТШХ у ВЕРХ.
Коефіцієнт селективності, який вимірює здатність колони відокремлювати сполуки 1 і 2, дорівнює:

Значення зазвичай складають від 1,05 до 2. Якщо стовпець ефективний (високий N), більш високі значення не потрібні.

РЕЗОЛЮЦІЯ: R
Мета хроматографії, звичайно, полягає у розділенні сполук. Ефективність цього поділу оцінюється за параметром, що називається роздільною здатністю R:

Два з'єднання відокремлюють, якщо різниця в часі їх утримання більша або дорівнює сумі напівширини піків (R> або = до 1). Насправді, враховуючи форму піків (Гауса) для R = 1, покриття сполук становить 2%. Для повного розділення знадобиться R> або = 1,5.
Комбінуючи різні попередні рівняння, можна виразити роздільну здатність у вигляді:

Ці відносини мають три терміни, а саме:
- ККД N
- вибірковість
- коефіцієнт ємності k '

Ми можемо/повинні грати на цих трьох умовах, щоб досягти поділу двох сполук.
(1) використання більш ефективних (високий азот) і довших колон (але будьте обережні, оскільки ми обмежені тиском);
(2) беручи низькоелюючі розчинники (високий k '), але немає сенсу виходити за межі k' = 10; це збільшує тривалість аналізів;
(3) шляхом розумного вибору стовпця та a s olvant доречно, тобто, граючи на вибірковість (це найважливіший момент, і тут виникає досвід користувача).