Модель in vitro для вимірювання імунної відповіді на малярію в контексті коінфекції ВІЛ

Вступ

Супутня інфекція, зараження множинними одночасними інфекціями, є нормою в природних умовах. Супутня інфекція може мати великий вплив на патологію захворювання та клінічне лікування будь-якої інфекції. У зв'язку із супутніми інфекціями, вакцина та ефективність препаратів, а також діагностичні тести можуть негативно впливати (огляд в 1). Незважаючи на їх важливість, більшість дослідників патогенних мікроорганізмів розглядають лише окремі інфекції.

Малярія та ВІЛ-1 (ВІЛ) є головними причинами захворюваності та смертності у всьому світі. Області малярії та ендемічності ВІЛ мають широке географічне перекриття, що ставить мільйони людей під загрозу більш важких клінічних захворювань 2-10. Ці два захворювання взаємодіють негативно. У ВІЛ-інфікованих осіб під час інфікування малярією спостерігаються більш високі вірусні навантаження та тимчасове зменшення кількості CD4 + Т-клітин, тоді як навантаження паразитами малярії та ризики клінічної та важкої малярії спостерігаються у коінфікованих осіб 2,3,5,7, 8,10 вище. Механізми, за допомогою яких ВІЛ збільшує тяжкість малярії, до кінця не вивчені і вимагають подальшого розслідування.

Тут ми описуємо метод, за допомогою якого малярія та ВІЛ-інфекція можуть вивчатися in vitro. Зокрема, цей метод дозволяє вивчати імунні відповіді, специфічні для малярії, у зв'язку з ВІЛ-інфекцією. Наш протокол описує універсальну систему кокультиви свіжоізольованих мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) від хронічно заражених ВІЛ-донорів та паразитованих P. falciparum еритроцитів (PfRBC), культивованих in vitro. Вплив антиретровірусної терапії ВІЛ на ці відповіді також можна вивчити, використовуючи проспективно зареєстровані РВМС від донорів ВІЛ (+) до та після лікування.

Використовував цю систему для вивчення впливу ВІЛ-інфекції на специфічні для малярії вроджені імунні відповіді 11,12 та зумів визначити, що малярійно-специфічні відповіді IFNy та TNF порушені в NK-клітинах, NKT-клітинах, γδ Т-клітини від донорів ВІЛ (+) до та після антиретровірусної терапії ВІЛ. Крім того, ми змогли використати цю систему, щоб визначити, що функції моноцитів також порушені у донорів ВІЛ (+), але одужують після антиретровірусної терапії ВІЛ.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Цей протокол вимагає набору донорів для сироватки та еритроцитів для використання в культурі паразитів, а ВІЛ (+) та неінфікованих донорів для ізоляції PBMC. Організаційні оглядові комісії повинні затвердити всі дослідження, а всі донори повинні надати поінформовану згоду до забору крові.

ПОПЕРЕДЖЕННЯ: Робота з зразками крові людини та паразитами малярії людини вимагає запобіжних заходів. Завжди носіть лабораторне пальто, рукавички та працюйте в кабінеті з біобезпеки рівня 2. У разі випадкового черезшкірного впливу на малярію людини повідомте про стан охорони здоров’я та безпеку для профілактичного лікування. Також слід проводити додаткові перевірки безпеки для роботи з кров’ю ВІЛ (+). Одягніть лабораторне пальто для умовиводу. Подвійна рукавичка (верхня рукавичка повинна бути латексною). Виконуйте всі дії у кабінеті біобезпеки рівня 2. Не використовуйте скло або гострі предмети. Не використовуйте водоструминний насос. Помістіть всі забруднені частини розчину вірусу або відбілювача принаймні на 1 годину до утилізації. Через 1 годину після нанесення промийте всі поверхні вірусом та УФ. Зверніть увагу, що кожна установа матиме свої власні правила біозахисту, яких потрібно дотримуватися. Повідомте про випадкові випадки впливу на ВІЛ-інфіковану кров здоров'я та безпеки для оцінки та врахування можливої ​​пост-експозиційної профілактики.

ПРИМІТКА: Присутні різні штами паразитів малярії P. falciparum. Для цих експериментів використовували ITG, але використовували різні штами. Чудові вказівки щодо заморожування та розморожування паразитів Plasmodium falciparum доступні на веб-сайті MR4 13.

1. Створіть RPMI-A для культури малярії

  1. Зробіть RPMI-0, змішавши 950 мл ddH 2 O, 1 упаковку порошку RPMI-1640, 6 г HEPES, 2 г гідрокарбонату натрію і 1,35 мг гіпоксантину.
  2. Розморожують інактивовану теплою сироватку людини від двох різних донорів. Донори АБ найкращі, але будь-які можна використовувати, коли паразити вирощуються в еритроцитах типу О (RBC). Підмітальні труби для перемішування. Якщо сироватка містить частинки або є густим віджимом при 2000 об/хв, а потім виберіть порцію рідини за допомогою фільтрувального блоку 0,45 мкм.
  3. Використовуючи 0,2 мкм м фільтр одиниці фільтра 180 мл RPMI-0, 20 мл людської сироватки (10 мл від кожного донора) і 0,5 мл 10 мг/мл гентаміцину.
    Примітка: Сироватка людини може засмічувати фільтри, тому потрібно більше одного фільтрувального блоку.
  4. Позначте флакон із середовищем RPMI-A, дату та джерело сироватки. Остудити, поки не знадобиться. RPMI-A може помутніти при охолодженні. Це нормально, але збільшення хмарності є ознакою забруднення.
    Примітка: ріст паразитів у різних донорських сироватках буде різним. Перед використанням рекомендується протестувати всі маси людської сироватки на гарний ріст паразитів.

2. Підготовка еритроцитів людини до культури паразитів

Примітка: Донори крові повинні бути типу О.

  1. Зберіть 7-10 мл крові в пробірки з кислотою цитрат-декстроза (ACD). Напишіть ідентифікатор донора та дату збору на етикетці.
  2. Зберігайте кров при температурі 4 ° C до необхідності. Для паразиту крові використовуйте культури протягом 1 місяця.
  3. Протріть верхню частину пробірки 70% етанолом. Обережно зніміть пробку та утилізуйте її. Перенесіть кров у пробірку об’ємом 15 мл. Спін 3 хв на 1000 x g. Видаліть плазму аспірацією.
  4. Оголення еритроцитів рівним об'ємом теплого RPMI-0. Спін протягом 5 хв при 1000 x g. Видаліть жирову шкіру відсмоктуванням, ресуспендуванням у 5 мл RPMI-0 і повторіть промивання ще 2 рази.
  5. Видаліть супернатант і додайте достатньо RPMI-A, щоб отримати суміш, що становить 50% еритроцитів за обсягом.
  6. Зберігати при температурі 4 ° C до необхідності.

3. Зберігання культур паразитів

4. Паразитна синхронізація

ПРИМІТКА. За день до експерименту синхронізуйте культуру паразитів, обробивши аланіном. Лише кільцеві паразити та неінфіковані еритроцити перенесуть таке лікування. Синхронізація аланіну дає на наступний день культуру чистого трофозоїту, яку можна використовувати в експериментах спільної культури. Не забудьте розпочати з культури паразитів, яка містить більшість кільцевих стадій паразитів.

  1. Приготуйте аланін, змішавши 8,01 г аланіну (300 мМ) і 0,365 г трис (10 мМ) в 300 мл ddH 2 O. Доведіть рН до 7,4. Фільтр стерилізують за допомогою 0,2 мкм м фільтрувальний блок.
  2. Попередньо підігріти розчин аланіну до 37 o C.
  3. Закрутіть культуру паразитів (5 хв х 1000 х г) і видаліть середовище.
  4. Гранули в 19 обсягах розчину аланіну (1 мл упакованих еритроцитів на 19 мл розчину аланіну). Інкубація протягом 15 хв при RT.
  5. Спін 5 хв х 1000 х г. Супернатант відсмоктується. Один раз вимити в RPMI-0. Надосадову рідину відсмоктують та ресуспендують у RPMI-A та встановлюють гематокрит

3%. Те саме, що в колбі, і поверніть до 37 ° C
Примітка: Для експериментів із спільною культурою потрібно мінімум 5% паразитомії трофозоїтів, причому 10% паразитемії вважається оптимальною.

5. Підготовка паразитів та еритроцитів до експериментів спільного посіву

  1. Використовуйте співвідношення 3 PfRBC на PBMC в експериментах спільної культури, щоб викликати запальну реакцію. Для розрахунку загального PfRBC кількісно визначають паразитемію, беручи тонкий мазок крові, як описано в 3.5, і гематокрит, підраховуючи кількість еритроцитів на мл культури паразитів за допомогою лічильної камери.
    Кількість PfRBC =% паразитемії х загальної кількості еритроцитів/мл х мл культури. Наприклад: 10 мл культури при 10 х 10 6 еритроцитів/мл і 10% паразитемії дорівнює 0,1 х 10 6/мл х 10 мл = 10 х 10 6 PfRBC.
  2. Обертати культуру паразитів протягом 5 хв при 1000 xg (RT). Аспіратне середовище та ресуспендування при 6 х 10 6 PfRBC на мл у RPMI-S + (500 мл RPMI-1640, доповнений L-глутаміном та HEPES, 10% нагрітий інактивований FBS, 1,5 мл гентаміцину, 5 мл 100 мМ пірувату натрію, 5 мл 10 мМ MEM незамінних амінокислот, 5 мл 5 мМ β-меркаптоетанолу).
  3. Контрольна кров (неінфікований еритроцит від того самого донора, який використовувався для утримання культури паразитів), розрахований гематокрит і ресуспендований в RPMI-S + при однаковій кількості еритроцитів на мл на культурі паразитів.

6. Виділення мононуклеарних клітин периферичної крові людини (PBMC)

7. Культура коінфекції малярії/ВІЛ

8. Виявлення імунних відповідей на малярію

ПРИМІТКА. Виконуйте спільні експерименти протягом 4 днів. За цей час не потрібно змінювати середовище. Оптимальний час буде залежати від типу клітинки, що цікавить, і поставленого питання. Інкубація від 12 до 48 годин є оптимальною для відповіді моноцитів на PfRBC, тоді як реакцію лімфоцитів найкраще спостерігати через 72 - 96 годин. Час потрібно буде оптимізувати, виходячи з експериментального питання. Можуть бути використані коротші періоди (2-4 год), коли взаємодія між неушкодженими PfRBC та PBMC представляє інтерес.

  1. Закручують пластину при 300 × g протягом 3 хв на клітинах гранул. З кожної лунки відбирають 700 мкл супернатанту культури.
  2. Обертайте супернатант при 1000 xg протягом 5 хв, щоб уникнути потрапляння сторонніх тіл.
  3. Аліквотний очищений супернатант за необхідності, мітити, переносити і знаходитись при -20 ° C до аналізу секретованих факторів, що підлягають LeistRMED.
  4. Проаналізуйте відповіді цитокінів/хемокінів методом ІФА або за допомогою збірки гранул (дотримуйтесь запропонованих виробником протоколів).
  5. Зберіть клітини, що залишилися в пластині, у розчині для стабілізації РНК і використовуйте їх для аналізу експресії мРНК за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі 14-16.

9. Внутрішньоклітинна проточна цитометрія для клітин-специфічних цитокінових відповідей із використанням РРМС, кокультивованих еритроцитами, інфікованими фальципарум

Примітка: Як зазначалося вище, тривалість спільної культури буде залежати від типу клітини, що цікавить. Якщо зацікавлені у моноцитарних реакціях, необхідний коротший інкубаційний період PfRBC. Час довший для вроджених реакцій лімфоцитів (yô Т-клітини, NK-клітини, NKT-клітини) і тим більше для CD4 і CD8-Т-клітин. Потрібна оптимізація.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Графіки показують рівні IFN & ggr; Виробництво клітин NKT (Малюнок 2), з CD56 + CD3 + γδ-воротами для збереження популяції клітин NKT (дані не наведені). Клітини культивували протягом 72 годин перед фарбуванням. Після фарбування на проточному цитометрі реєстрували 100 000 клітин CD3 +, щоб отримати досить великі популяції клітин NK, NKT та γδ (цікаві клітини). На кожному графіку показано мінімум 5600 комірок NKT. Виробництво TNF отримують таким же чином (дані не наведені). На графіках чітко видно, що IFN & ggr; Продукція нижча у клітинах ВІЛ (+) осіб проти ВІЛ (-) осіб, які зазнали дії PfRBC.

Аналіз проточної цитометрії дуже суб'єктивний. Тому важливо мати усі відповідні засоби контролю для кожного експерименту (див Малюнок 2). Фонові значення обчислюють із використанням зразків FMO, що дозволяє істинно уявляти забарвлення цитокінів.Клітини, стимульовані ПМА/іономіцином, використовували як позитивний контроль (дані не наведені). РМА та іономіцин є потужними стимуляторами вироблення Т-клітинних цитокінів. Відсутність продукції IFN у цих зразках, швидше за все, є проблемою з протоколом фарбування. Однак інші змінні, такі як життєздатність клітин або неактивні реагенти, також можуть бути винними.

відповіді
Рисунок 1. Ілюстрація градієнта Фіколла після віджимання докази положення PBMC.

vitro
Рисунок 2. Продукція γ-IFN природними Т-клітинами-кілерами. Блок-схеми були отримані шляхом замикання на клітинах CD56 + CD3 + γδ (мінімум 5600 подій). Виробництво IFNy виявляється у зразку ВІЛ (-) із стимульованим P. falciparum, заражені еритроцитами. Ця відповідь цитокінів більше не очевидна в контексті хронічної ВІЛ-інфекції. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Наш протокол був оптимізований для вивчення ко-інфекції ВІЛ-малярії найбільш реально in vitro. По-перше, для культури паразитів малярії потрібні свіжі еритроцити та сироватка людини. Це має вирішальне значення для підтримки здорової популяції паразитів малярії. Паразитні лізати не можна замінити живими паразитами, оскільки вироблення цитокінів набагато швидше та інтенсивніше при використанні живого P. falciparum заражений еритроцитами (PfRBC) 17.18. Крім того, активація типів клітин, таких як NK-клітини, вимагає загальних PfRBC і не ефективно обробляє лізати паразитів. Це може бути пов'язано з необхідністю прямого контакту між PfRBC і лейкоцитами, або може бути пов'язано з нестабільною природою ліганду, отриманого паразитами, який взаємодіє з рецепторами клітинної поверхні 18. Культури малярії PfRBC також повинні бути добре синхронізовані (Протокол 4) перед експериментом. Синхронізовані PfRBC для поліпшення відтворюваності експериментальних даних. Хоча цей протокол deSchreiber використовує трофозоїтову стадію PfRBC для спільної культури, він може бути легко модифікований для вивчення кільцевої стадії PfRBC.

Лейкоцити людини штучно інфіковані ВІЛ, і цей метод був використаний у дослідженнях, проведених дослідженнями спільної інфекції малярії та ВІЛ 20. Однак це не моделює порушення імунної системи, що призводить до хронічної ВІЛ-інфекції. У цій системі спільної культури ми використовуємо PBMC, виділені від людей, які хронічно інфіковані ВІЛ-1. Якщо для учасників необхідне дослідження, важливо ретельно відібрати цю сукупність. Критерії включення та виключення мають вирішальне значення для забезпечення мінімальної мінливості та максимальної відтворюваності. Нашими критеріями було чітке визначення хронічної ВІЛ-інфекції (> 1 рік ВІЛ-інфікованих із зменшенням кількості CD4 + Т-клітин на> 50 клітин/мм 3/рік) та виключення всіх, хто одночасно заразився. Це гарантує, що отримані результати можуть бути віднесені до наслідків хронічної ВІЛ-інфекції, а не якоїсь іншої інфекції. Крім того, оскільки ми були зацікавлені вродженою імунною відповіддю на виключену малярію, ми були донорами, які мали попередню малярійну інфекцію.

ВІЛ-інфіковані контролі використовуються для кожного донора ВІЛ (+) під час кожного зразка, що дозволяє нормалізувати дані. Слід зробити спробу зрівняти контроль над відповідними донорами ВІЛ (+) принаймні для віку, але бажано і для статі (хоча в нашому попередньому дослідженні 12 ми не спостерігали значної різниці в підмножинах клітин або відповіді цитокінів між жінками та чоловіками ВІЛ-неінфіковані учасники). Якщо заплановано проспективне відбір зразків, корисно підтримувати однаковий ВІЛ-інфікований контроль протягом кожного часу відбору проб. Експериментальні реакції варіюються залежно від кількох факторів, включаючи стан здоров’я PfRBC, ступінь їх синхронізації, рівні паразитемії та зрілість PfRBC та рівні гематокриту. Потрібно подбати про те, щоб якомога більше з них підтримували гармонію між експериментами. Нормалізація до ВІЛ-інфікованого контролю дозволяє деяким чином враховувати ці змінні.

Наявність свіжих клітин є надзвичайно важливим, щоб уникнути штучних результатів. Заморожування та розморожування зразків можуть мати значний вплив на життєздатність клітин 21,22, продукцію цитокінів 23-26 та маркери фенотипу клітинної поверхні 27.

Якщо моноцити становлять особливий інтерес, важливо, щоб скло не використовувалося в протоколі. Необхідно дотримуватися моноцитів на склі та багатьох інших пластмасах 28. Ми використовуємо поліпропіленові пластикові піпетки, піпетки та трубки скрізь, щоб мінімізувати адгезію моноцитів і остаточне видалення з популяцій досліджуваних клітин.

Описаний протокол є універсальним, який може бути використаний для вивчення реакцій протягом годин або днів залежно від клітин, що цікавлять. Для оптимального продукування цитокінів, викликаного PfRBC, із вроджених лімфоцитів, ми вимірювали базову лінію проточної цитометрії через 2 або 3 дні. Коли розглядають моноцити, рекомендуються більш ранні часові моменти (1 або 2 дні). Ця система дозволяє виділити декілька типів клітин та реакції клітин за допомогою проточної цитометрії, секреторні відповіді вимірювати в супернатантах клітин та оцінювати профілі експресії в екстрагованій РНК. Крім того, використання антитіл для блокування або нейтралізації специфічних рецепторів; цитокіни можуть бути використані в цій системі для подальшого розрізання механізмів. Ми успішно застосували блокаду рецепторів IL-18, щоб передбачити рецептор IL-18 у реакціях IFN, викликаних PfRBC 12. Ця система забезпечує реалістичний метод, за допомогою якого можна оцінити низку вроджених імунних реакцій на малярію, пов’язаних з ВІЛ-інфекцією.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.