Моделювання токсичного мускаринового рецепторного комплексу МТ7 за термодинамічними даними -

Моделювання комплексу мускаринових/токсичних рецепторів МТ7 за термодинамічними даними Гійом Летельє Навести цю версію: Гійом Летельє. Моделювання комплексу мускаринових/токсичних рецепторів МТ7 за термодинамічними даними. Науки про життя [q-біо]. Університет Пари-Дідро - Париж VII, 2008. Французька. tel-00447060 HAL Id: tel-00447060 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00447060 Надіслано 14 січня 2010 р. HAL - це мультидисциплінарний архів відкритого доступу для зберігання та розповсюдження науково-дослідних документів, незалежно від того, публікуються чи ні. Документи можуть надходити від навчальних та дослідницьких установ у Франції чи за кордоном, або від державних або приватних дослідницьких центрів. Мультидисциплінарний відкритий архів HAL призначений для зберігання та розповсюдження наукових документів наукового рівня, опублікованих чи ні, від французьких або зарубіжних навчальних та дослідницьких установ, державних чи приватних лабораторій.

токсичного

Міждокторська школа /// Біомоделювання комплексу мускаринових рецепторів/токсину МТ7 за термодинамічними даними Представлено та публічно підтримано 8 жовтня 2008 р. Для здобуття наукового ступеня доктора університету імені Дениса Дідро за спеціальністю «Геномний аналіз та молекулярне моделювання». журі: Директор дипломної роботи: доктор Бернард ГІЛКІН Доповідачі: Рецензенти: д-р Майкл НІЛЬГЕС д-р Серж КРУЗІ проф. Gif sur Yvette

Глава 1: Абревіатури AR Адренергічний рецептор Ах ацетилхолін ДНК Дезоксирибонуклеїнова кислота AFM Атомно-силова мікроскопія AMPc Циклічний аденозин монофосфат TCM Потрійний комплекс модель CHO Яєчник китайського хом'ячка DAG Діацилгліцерол egfp Посилений зелений флуоресцентний білок GFG FTT FTG -фосфат HADDOCK Біомолекулярна стиковка з високою двозначністю hm1 Мускариновий рецептор людини підтип 1 hm3 Мускариновий рецептор людини підтип 3 IP3 Інозитол три-трифосфат M моляр (моль. -1) махр наносекундний PDB Банк даних білка PKA Протеїнкіназа A PKC Протеїнкіназа C PLC Фосфоліпаза типу С pm пікомолярний RCPG Білок, зв’язаний рецептор G RMN Ядерний магнітний резонанс RMSD Середня квадратична область інтересу SDS-Сторінка S додецилсульфат одію електрофорез у поліакриламідному гелі ТКМ Модель потрійного комплексу ТМ Трансмембранний домен 4

Глава 1: Вступ 5.1.2. Дані не враховані 147 5.1.2.1. W91 M1/​​Y30 токсичних 147 R52 токсичних/W400 M1 149 5.2. Дімеризація мускаринових рецепторів 150 5.2.1. Характер поверхні взаємодії 150 5.2.2. Режим складання димеру рецептора 151 5.2.3. Олігомери вищого порядку 154 5.3. Молекулярна основа фармакологічних властивостей токсину 156 5.3.1. Сайт посилань 156 5.3.2. NMS/MT7/hm1 стехіометрія 156 5.3.2.1. Гіпотеза 1: 1 димер М1, 1 токсин, 1 НМС 156 5.3.2.2. Гіпотеза 2: 1 димер М1, 2 токсини, 2 НМС 157 5.3.3. Висока спорідненість до зв'язування 158 5.3.4. Селективність для підтипу мускаринових рецепторів М1 161 Глава 6: Висновки та перспективи 164 6.1. Перспективи: молекулярні основи алостерії 166 Розділ 7: Покажчик рисунків 171 Розділ 8: Бібліографія 175 Розділ 9: Додатки 190 9.1.1. Ортостеричні ліганди RCPG 191 9.1.2. Вирівнювання послідовностей hm1 та родопсину 192 9.1.3. Моделювання сховища 193 9.1.4. Моделювання активованої молекулярної динаміки 196 9.1.5. Моделювання молекулярної динаміки в мембрані 198 9.1.6. Орієнтир кодів молекулярної динаміки на машині TERA10 200 8

Глава 1: Вступ

Глава 1: Вступ Рисунок 4: Будова бичачого родопсину Позаклітинний домен позначений фіолетовим кольором, а петля E2 - червоним. На основі координат PDB 1U19 (Okada, Sugihara et al. 2004). 17

Глава 1: Вступ 1.4.1. Підтипи мускаринових рецепторів Після секвенування геному людини виявилося, що у людини було кілька підтипів мускаринових рецепторів з дуже високою подібністю послідовності (рис. 11). В даний час у людини відомо 5 підтипів мускаринових рецепторів. У той час як ті, що мають парні числа (1, 3, 5), переважно з'єднані з шляхом інозитол-трифосфату, а ті, що мають непарні числа, натомість з'єднані з циклічним підсилювачем. Локалізація мускаринових рецепторів була широко вивчена (Abrams, Andersson et al., 2006). Вони розподіляються по багатьох органах, таких як сечовий міхур, кишечник, слинні залози, серце, око тощо. Особлива увага була приділена їх розподілу в мозку (Volpicelli and Levey 2004), де вони, серед іншого, відіграють роль у збудливості нейронів, синаптичній пластичності, а також механізми зворотного зв'язку щодо ацетилхоліну. 5 рецепторів експресуються в різних областях мозку. Підтипи M1, M4 та M5, наприклад, локалізовані на рівні центральної нервової системи, тоді як підтипи hm2, 3 є на рівні периферичної нервової системи. 30

Глава 1: Вступ Рисунок 11: Вирівнювання послідовності 5 підтипів мускаринових рецепторів Трансмембранні спіралі позначені зеленими смужками 31

Глава 1: Вступ Родопсин: порожнина зв’язування сітківки, ця порожнина розташована глибоко в серці пучка спіралі. (A) Рисунок 13: Модель ортостеричного ділянки зв'язування рецептора hm1 A) ендогенний ліганд, ацетилхолін (пурпуровий). B) ортостеричний антагоніст, N-метилкополамін (пурпуровий) За даними Гудвіна (Goodwin, Hulme et al. 2007) (B) 34

Глава 1: Вступ Рисунок 14: Зв’язування орто- і алостеричних лігандів з мускариновим рецептором М2 Два ліганди мають жовтий колір, залишки Y177 та W422 мускаринового рецептора М2 - червоним. За даними Ягера (Jager, Schmalenbach et al. 2007) 36

Глава 1: Вступ 1.5.2. Структура Мускаринові токсини - це сімейство пептидів із 65-66 залишків (рис. 16) з 4 дисульфідними зв’язками. В даний час їх загалом десяток, але не всі з них були послідовно розподілені. Структура мускаринового токсину МТ2 (рис. 31) була визначена методом ЯМР (Segalas, Roumestand et al. 1995), потім кристалізацією та рентгенівською дифракцією з роздільною здатністю 1,50 Å (код PDB 1FF4). Ця структура являє собою трипальцеву складку, організовану в п'ять антипаралельних β-ниток, з'єднаних між собою трьома петлями (I, II і III). Ядро білка стабілізується чотирма дисульфідними містками. Цей структурний мотив поширений у багатьох сімейства зміїних токсинів (Galat, Gross et al. 2008), таких як α-нейротоксини (Popot and Changeux 1984), фасцикуліни (Du, Marchot et al. 1992) або кардіотоксини. Рисунок 16: Вирівнювання послідовностей мускаринового токсину 4 послідовності дисульфіду представлені під послідовностями Рисунок 17: Кристалографічна структура токсину МТ2 (код PDB 1FF4) 38

Глава 1: Вступ Рисунок 19: Вирівнювання послідовності петлі токсину II та петлі рецептора E2 Ми можемо помітити тривожну подібність послідовності між петлею токсину II та петлею рецептора E2 (рис. 19), що може припустити, що токсин може витіснити петлю рецептора та прийняти його місце. 40

Глава 1: Складне введення, але більш реалістичне щодо проблем біології, ніж проблеми, пов’язані/пов’язані на початку. Критеріями оцінки моделі є: F nat: частка передбачуваних природних контактів/кількість контактів природних L_rms: RMSD-комплексу на атомах основи ліганду шляхом накладання передбачуваних і природних I_rms: RMSD-рецепторів на атоми основної залишки на межі розділу між моделлю та нативним комплексом. Щоб отримати посилання з точки зору RMSD, Chotia та співавт. (C. Chothia 1986) встановили, що в середньому два незалежних визначення кристалографічної структури одного і того ж білка призводять до середніх відхилень 0,5 AT. Що стосується структур, визначених ЯМР, то значення різниць між моделями можуть досягати більше 1,5 Å. 46

Глава 1: Вступ 3. У третьому прикладі були використані термодинамічні дані мутацій в аланіні між комплексом upar і upa. Комплекси генерували шляхом введення обмежень на відстань, отриманих з аналогії між upa та пептидом-інгібітором. Комплекси сортували порівнянням значень варіацій розрахункової та експериментальної енергій зв’язку. Для двох із цих комплексів кристалографічна структура була опублікована після цієї роботи з моделювання (Bourne, Talley et al. 2005) (код pdb 1VI5); (Huai, Mazar et al. 2006; Schneider, Ader et al. 2008) (код PDB 2FD6). Цей підхід може бути підтверджений порівнянням моделей із кристалографічними структурами. Для комплексу BgK/Kv11 модель можна порівняти з недавніми даними, отриманими за допомогою твердотільного ЯМР (Schneider, Ader et al. 2008). Для порівняння цих моделей із кристалічними структурами ми використовуємо критерії, запропоновані CAPRI і представлені раніше (пор. 1.6.3): Fnat, L-rms та I_rms. Слід зазначити, що у змаганні CAPRI для кожної цілі кожна група може представити кілька рішень. У цій роботі з моделювання комплексів за термодинамічними даними запропонована лише одна модель. 52

Глава 1: Вступ (A) (B) (C) Рисунок 23: Накладання моделі nachr-α7/α-кобратоксину на кристалічну структуру AChBP/α-кобратоксину AChBP та α-кобратоксину мають зелений та синій кольори. Для моделі nachr-a7 та α-кобратоксин мають відповідно фіолетовий та червоний кольори. (C) Масштабування місця зв’язування Суперпозиція вторинних структурних елементів двох комплексів дає відхилення 2,3 Å середньоквадратичного значення між моделлю та кристалографічною структурою. Малюнок 23 показує, що дві структури перекриваються, вказуючи на те, що положення та орієнтація токсину були правильно передбачені. Коли два рецептора накладаються, різниця між С токсинів (L-rms) дорівнює 4,4 Å. Основні відхилення локалізовані в кінцях петель токсину і в петлі С рецептора, області, яка не дуже збережена між AChR-7 і AChBP (ФІГ. 23C). Значна гнучкість цієї області спостерігається у кількох складних лігандних структурах з АЧБП (Celie, Kasheverov et al. 2005; Hansen, Sulzenbacher et al. 54

56 Розділ 1: Вступ

Глава 1: Вступ (A) (B) (C) Рисунок 24 Моделювання калієвого каналу A) модель комплексу KcsA/каліотоксин, отримана на основі даних ЯМР Lange, Giller et al. 2006, Б) модель комплексу Kv1.1/BgK (BgK червоного кольору з лізином 25 синього кольору; представлені лише три субодиниці Kv1.1 (блакитний, зелений та жовтий) C), вдосконалена за допомогою розрахунку енергій зворотного зв'язку та представляючи три водневі зв’язки на межі розділу. BgK позначений стрічкою з лізином 25 жовтим кольором; скелет Kv1.1 зелений. 58

Глава 1: Вступ Рисунок 25: Суперпозиція моделі та кристалографічна структура upar/upa. Для кристалографічної структури upar і upa мають відповідно блакитний та оранжевий кольори. Для моделі upa має червоний колір, а три домени D1, D2 та D3 upar показані відповідно рожевим, пурпуровим та синім кольорами. 1.6.6. Висновок Ці три приклади показують, що моделювання комплексів білок/білок на основі термодинамічних даних приводить до структур, які досить добре узгоджуються з досвідом, зокрема щодо основних залишків взаємодії. З іншого боку, вони показують межі використовуваної процедури. Відсутність відбору проб рецепторів та конформерів ліганду до застосування процедури стикування не дозволяє повністю врахувати гнучкість партнерів. Нарешті, здається, що розслаблення комплексу за допомогою молекулярної динаміки повинно виконуватися для того, щоб оптимізувати модель та підтвердити її стійкість. 60

Глава 1: Вступ 61

Розділ 2: Структурне дослідження партнерів Розділ 2: Структурне дослідження партнерів 62

Глава 2: Структурне дослідження партнерів 2.1. Приймач hm1 2.1.1. Пептидні послідовності Мускаринові рецептори мають короткий N-кінцевий сегмент із 21 амінокислоти перед першою трансмембранною спіраллю (Малюнок 26А). Було показано (Weill, Galzi et al. 1999), що відсутність цього сегмента не впливає на зв'язування лігандів з рецептором. Ще однією особливістю мускаринових рецепторів є наявність великого внутрішньоклітинного домену I3 (рис. 26А). Цей майже 180 амінокислотний довгий домен розташований між трансмембранними спіралями 5 і 6. Рекомбінантні мускаринові рецептори, у яких ця внутрішньоклітинна частина замінена коротшою петлею (видалення залишків від 231 до 357), були побудовані і охарактеризовані групою В. Ільєна (Weill, Galzi et al. 1999). Нарешті, місця глікозилювання також мутували. Ці рекомбінантні рецептори все ще мають здатність зв'язувати свої ліганди та активувати білки G. Пептидна послідовність, яку ми будемо використовувати для моделювання hm1, є формою, де N-ter сегмент усічений з залишків 1-20, а також короткою формою hm1. петля I3, описана Weill et al (Weill, Galzi et al. 1999) (Малюнок 26B). 63

Глава 2: Структурне дослідження партнерів (A) Рисунок 26: Модифікація петель рецептора M1 Схематична організація дикого M1 (A) та після модифікації (B). частина Nter була видалена до залишку 20. Залишки 231 - 357 внутрішньоклітинної петлі I3 також видаляються. (B) 2.1.2. Моделювання спірального ядра Родопсин було єдиною структурою RCPG, доступною на початку цієї роботи. Тому він був використаний як основа для побудови моделі пучка спіралі мускаринового рецептора шляхом порівняльного моделювання. Незважаючи на відносно низькі значення ідентичності послідовності між двома білками (24% у спіралях), їх вирівнювання є однозначним через наявність областей з високим рівнем збереженості у спіралях (Baldwin, Schertler et al. 1997). 2.1.3. Прогнозування петель Петля E1 рецептора hm1 була змодельована порівняно з родопсином (фіг. 27), з якою вона має достатню схожість (30%). Наявність дисульфідного містка між залишком 178 петлі Е2 і залишком 98, що належить трансмембранній спіралі, обмежує конформацію основи петлі до конформації, подібної до такої, що стосується родопсину. Отже, ці залишки становлять 64

Глава 2: Структурне вивчення партнерів, також модельоване гомологією. З іншого боку, структура родопсину не є придатною моделлю для прогнозування конформацій кінця петлі Е2, а також петлі Е3. Кінець циклу E2 (169-177), отже, передбачався повністю ново за допомогою програми RAPPER (Фернхем, Доре та ін., 2006). Для циклу E3 (391-396) програма RAPPER ідентифікувала фрагмент в PDB (код 1KQF), щоб направити прогноз. 38 молекул води, внутрішніх до кристалічної структури родопсину, також були збережені в моделі hm1 (рис. 28). Остаточну модель оцінював сервер RAMPAGE (Lovell, Davis et al. 2003). На малюнку 29 видно, що 98% залишків знаходиться у дозволених регіонах діаграми Рамачандрана (Ramachandran, Ramakrishnan et al. 1963). Отже, ця модель не має істотних дефектів у геометрії. Рисунок 27: Вирівнювання послідовностей позаклітинних петель E1 родопсину та hm1 Рисунок 28: Модель рецептора hm1 Модель побудована за гомологією на основі структури родопсину. 65

Глава 2: Структурне дослідження партнерів Рисунок 29: Діаграма Рамачандрана моделі hm1 Кількість залишків у сприятливих регіонах: 265 (92,7%) Кількість залишків у дозволених регіонах: 14 (4,9%) Кількість залишків у заборонених регіонах: 7 ( 2,4%) 66

Розділ 2: Структурне дослідження партнерів, щоб мати надійну модель нашого ліганду та звільнити нас від можливих структурних артефактів через наявність йоду або прищеплення петлі іншого токсину. (A) Рисунок 30: Кристалічна структура модифікованого токсину МТ7 (а) МТ7, що містить два атоми йоду (червоним) на tyr51. (b) Химера MT7 з петлею MT1 III (зеленим кольором) (B) (A) Рисунок 31: Порівняння структур MT7, модифікованих MT2 A) Химера MT1/MT7 (блакитна), накладена на структуру MT2 (синя) . Б) ді-йодний токсин (пурпуровий), накладений на МТ2 (синій). (В) 68

Глава 2: Структурне дослідження партнерів Рисунок 32: Структурна модель токсину МТ7 Структурна модель (Рисунок 32) токсину МТ7 представляє складку з трьох пальців, що складається з гідрофобного ядра, утримуваного 4 дисульфідними мостами та 3 петлями від цього серце. Аналіз геометрії цієї структури (рис. 33) на сервері RAMPAGE (Lovell, Davis et al. 2003) демонструє, що всі залишки білка знаходяться в дозволених регіонах діаграми Рамачандрана (Ramachandran, Ramakrishnan et al. 1963), і що 63 залишки знаходяться в найбільш сприятливих регіонах (надають перевагу). Отже, ця модель має властивості кристалографічної структури якості. 69

Глава 2: Структурне дослідження партнерів Рисунок 33: Діаграма Рамачандрана щодо структури токсину МТ7 Кількість залишків у сприятливих регіонах: 63 (98,4%) Кількість залишків у дозволених регіонах: 2 (3,0%) Кількість залишків у заборонених регіонах: 0 (2,4%) 70

Розділ 2: Структурне дослідження партнерів 71

Глава 3: Прогнозування структури комплексу hm1/mt7 Розділ 3: Прогнозування структури комплексу hm1/mt7 72

Розділ 3: Прогнозування структури комплексу hm1/mt7 3.1. Термодинамічні вимірювання hm1/mt7 Експерименти з мутагенезу та термодинамічні вимірювання проводила група Дениса Сервента (CEA SIMOPRO). 3.1.1. Модель потрійного комплексу Спочатку пропонувалось описати поведінку RCPG, що зв'язує як його ортостеричний ліганд, так і білок G (De Lean, Stadel et al. 1980), модель потрійного комплексу (TCM) насправді може бути узагальнена на будь-який рецептор, що одночасно зв'язує його ортостеричний ліганд та інший ліганд у другому, топографічно іншому місці. У цій моделі ми розглядаємо лише один стан активації рецептора, до якого ортостеричний ліганд A і алостеричний ліганд X можуть одночасно зв'язуватися з відповідними спорідненостями до вільних рецепторів KA і K X. Наслідок зв'язування одного з ліганди до рецептора мають змінити кінетику асоціації та дисоціації іншого ліганду. Різниця в спорідненості ортостеричного ліганду до вільного рецептора або зв’язаного з алостеричним лігандом визначає кооперативність позначеної системи α. Коефіцієнт α> 1, α d цільове значення: E мінуси = ½. К. (d- d ціль) ² Якщо d