Підготовка зразків личинок дрозофіли для газової хроматографії-мас-спектрометрії (GC-MS)

Резюме

Цей протокол описує, як підготувати личинок дрозофіли до метаболомічного аналізу на основі GC-MS.

Анотація

Вступ

Плодова муха Drosophila melanogaster виникла як ідеальна система для вивчення молекулярного механізму, який регулює проміжний обмін речовин. Більшість метаболічних шляхів не тільки збережені між людьми та дрозофілою, але важливі сенсори поживних речовин та регулятори росту, такі як інсулін, Tor та Myc, також активно працюють у льоту 1, 2. Таким чином, дрозофіла використовується для дослідження метаболічних основ людських захворювань, діабету та ожиріння, аж до нейродегенерації та раку. У цьому контексті розвиток личинок дрозофіли забезпечує ідеальні умови для рівня метаболізму, відомого як аеробний гліколіз або ефект Варбурга. Подібно до того, як багато пухлин генерують аеробну біомасу з вуглеводів, так робіть це, активуючи аеробний гліколіз личинок дрозофіли, щоб сприяти зростанню розвитку 3, 4, 5. Ці подібності між метаболізмом личинки та пухлини встановлюють дрозофілу як модель для розуміння того, як аеробний гліколіз регулюється in vivo.

Незважаючи на те, що муха стала популярною моделлю метаболізму, більшість досліджень дрозофіли спираються на методи, призначені для вимірювання окремих метаболітів 3, таких як трегалоза, тригліцериди або АТФ. Оскільки для вимірювання кожного метаболіту необхідний спеціальний протокол, дослідження, засновані на аналізі, трудомісткі, дорогі та упереджені щодо цих сполук, які можна виміряти за допомогою комерційних наборів. Рішення цих обмежень з’явилося у галузі метаболоміки, яка забезпечує більш ефективний та неупереджений засіб метаболізму дрозофіли. На відміну від досліджень, заснованих на аналізі, один метаболічний аналіз може одночасно виміряти сотні метаболітів малих молекул і забезпечити всебічне розуміння метаболічного стану організму 6, 7. Ця методика значно розширила метаболічні дослідження дрозофіли та представляє майбутнє цієї нової галузі 8 .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

2. Збір зразків личинок

    Вік личинок до бажаної стадії. Коли личинки L3 збираються, ресинхронізують зразки при линьці L2-L3. Повторна синхронізація часто досягається за допомогою описаного раніше методу, який використовує передні дихальні отвори як основний розлад розвитку. Альтернативно, личинки середини L3 можуть бути синхронізовані з репортерним геном SGS3 16.
    Примітка: У цьому контексті ми знаходимо середні личинки L2 (

30 сек. У цей час личинки опускаються на дно пробірки, але дріжджі залишаються у суспензії. Як тільки всі личинки сформують пухку гранулу, видаліть розчин NaCl піпеткою об’ємом 1 мл.

  • Повторіть кроки 2.4 і 2.5 двічі, або до останнього промивного розчину.
    Примітка: Можуть знадобитися додаткові етапи промивання, якщо зібрана проба містить надмірну кількість дріжджів.
  • Центрифугуйте зразки при 2000 × g протягом 1 хв при 4 ° C.
  • Видаліть залишок розчину піпеткою на 200 мкл.
  • Негайно заморозити зразок у рідкому азоті.
    Примітка: Протокол може бути призупинений на цьому етапі. Зразки можна зберігати при -80 ° C до 3 місяців

    • 3. Перенесіть зразки в бісерні пробірки

    До 16 годин).
    Примітка: За потреби протокол може бути призупинений на цьому етапі. Висушений зразок можна зберігати при -80 ° C

    (5) хімічна дериватизація

    Примітка: У більшості випадків користувач виконує цей крок за допомогою базової установки масової спектроскопії. Цей протокол призначений для використання з 30-метровими колонами GC із захисною колоною 5 м.

    1. Випадково замовити зразок.
    2. Підготуйте ГХ-МС.
      1. Встановіть швидкість потоку газу-носія гелію на 1 мл/хв.
      2. Встановіть температуру подачі на 250 ° C.
      3. Запрограмуйте GC на такий градієнт температури:
        1. Початкова температура 95 ° C з впливом 1 хв.
        2. Піднімайте температуру до 110 ° C зі швидкістю 40 ° C/хв протягом 2 хв.
        3. Збільште набір до 250 ° C до 5 ° C/хв.
        4. Збільште кінцеву зупинку на 4 хв зі швидкістю 25 ° C/хв до 330 ° C.
      4. Встановіть затримку розчинника на 3,5 хвилини
        Примітка: Час можна змінити відповідно до системи GC-MS. Цей крок призначений для запобігання пошкодженню детектора MSTFA та MOX.
    3. Введіть 1 мкл дериватизованого зразка в ГХ-МС (співвідношення розділених 10: 1).
      Примітка: Введіть 2 мкл зразка, якщо інтенсивність піків занадто низька. Порядок введення зразків слід рандомізувати.
    4. Експлуатуйте мас-спектрометр у повному режимі сканування в діапазоні мас 50 - 500 м/з.

    1. Аналіз метаболомічних даних використовує цілеспрямований або нецільовий підхід. Цілеспрямований аналіз фокусується на вимірюванні кількості певного набору метаболітів, таких як: B. вимірювання лактату, які ми описуємо нижче. Навпаки, нецільовий аналіз використовує неупереджений підхід для виявлення будь-якої метаболічної функції, яка суттєво змінюється між двома наборами зразків.
      Примітка: Наша лабораторія в основному використовує безкоштовні програми MetAlign 17 та MetaboAnalyst 18, 19 для аналізу даних. Оскільки адекватний опис етапів контролю якості, нормалізації та обробки даних виходить за рамки даного рукопису, ми звертаємось до користувача до більш детальних протоколів, присвячених обробці даних 20, 21, 22. Крім того, блок-схему, що описує етапи цього аналізу, можна знайти деінде 8.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Мутанти лактатдегідрогенази (dLDH), у яких відсутня активність dLDH 4 та генетично відповідні контролі, були зібрані у вигляді личинок середини L2 та оброблені відповідно до протоколу, описаного вище. У порівнянні з контролем, у личинок мутантів спостерігаються значні зміни лактату, пірувату та L-2-гідроксиглутарата-4. Спектри були придбані в системі MS Agilent GC6890-5973i. Приклад створення спектрів GC-MS за допомогою нашого протоколу наведено на рисунку 1показано. Є багато видимих ​​особливостей і помітний пік трегалози, який, як правило, є найбільшим піком у зразку личинки і, як правило, перенасичений (малюнок 1АB.). Індивідуальний спектр зразка негативного контролю показаний на малюнку 1показано. Хоча в негативній контрольній пробі все ще є видимі піки, інтенсивність та кількість піків зменшуються порівняно з експериментальними зразками, показаними в Рис. 1А, B.. Ці піки по суті є результатом кровотечі з колонки, внутрішнього стандарту (бурштинова кислота-d4 кислота), FAME та забруднюючих жирних кислот. Невдала підготовка зразка генерує спектр, подібний до спектру на малюнку 1показано.

    Спектри були попередньо оброблені MetAlign 17, а дані нормалізовані за внутрішнім стандартом та масою гранул. Далі дані були подані до MetaboAnalyst 18, 19 для статистичного аналізу. Принциповий компонент (Аналіз, PCA) чітко показує, що ці дві групи відокремлюються одна від одної, жодної групи немає відхилень (Рисунок 2A). Подальший аналіз показує суттєві зміни в метаболіті, відомі через втрату dLDH (рис. 2b) 4 постраждають.

    личинок

    ілюстрація 1 : Репрезентативні спектри GC-MS від дрозофіли Екстракт личинок. (ВІД) Типові спектри екстрактів личинок середнього L2 від дикого типу (WT) та dLDH-мутантів (KO). (C) репрезентативний спектр GC-MS, породжений негативним контролем (NC). Більшість піків у цьому діапазоні - від внутрішніх, знаменитостей та жирних. (Д-Ж) Порівняно із зразками WT, зразки KO демонстрували підвищений рівень (D) Піруват і лактат (E) і (F) 2-Гідроксиглутарат (2-HG) зменшився. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

    зразків

    Малюнок 2 : Статистичний аналіз показує різні метаболічні профілі між диким типом (WT) та dLDH Личинки нокауту (КО). (A) Графік результатів PCA. (B) -Метаболіти, які мутували зміни рівня dLDH. Усі точки даних складаються відносно середнього значення елемента управління WT, якому встановлено будь-яке значення 100. Перед аналізом дані, нормалізовані щодо внутрішньої бурштинової кислоти d4, були стандартними і для маси гранул личинок. Дані як середнє значення ± одне стандартне відхилення. p Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Метаболоміка пропонує унікальну можливість виміряти метаболічні реакції, щоб скласти проміжний метаболізм. Однак чутливість цієї технології робить дані вразливими до генетичного фону, ознак розвитку та широкого спектру тиску навколишнього середовища, включаючи температуру, вологість, щільність населення та доступність поживних речовин. Отже, якісний та відтворюваний метаболомічний аналіз вимагає збору зразків у дуже контрольованих умовах. Хоча деякі публікації з цього питання підкреслюють 3, 8, 23, тут ми пропонуємо покроковий метод збору личинок, призначений для забезпечення відтворюваності.

    Найбільш часта причина мінливості в аналізі метаболоміки виникає внаслідок неможливості годувати груддю або зупинити метаболічні реакції після захоплення зразка. У цьому контексті метаболізм припиняється при заморожуванні у рідкому азоті, а метаболічні ферменти руйнуються, коли зразок гомогенізується при -20 ° C метанолу. Якщо припустити, що користувач приділяє особливу увагу збереженню зразка замороженим до вилучення метанолу, наш протокол покликаний забезпечити, щоб дані метаболоміки, що генеруються цією процедурою, представляли точний знімок метаболізму личинок. Якщо користувач відчуває неприйнятну мінливість даних, користувачеві слід переглянути протокол збору та вилучення метаболітів, приділяючи особливу увагу забезпеченню (1) метаболізму швидко вгамовується (кроки 2.9-4.2) та (2) зразок стає ефективним гомогенізують у 90% метанолі (етап 4.4). У зв'язку з цим багато фабрик з бісеру не забезпечують достатньої потужності для гомогенізації зразків протягом зазначеного часу, і ми рекомендуємо користувачеві використовувати прилад, який використовувався в попередніх дослідженнях 8.

    Нарешті, наведені тут методи є потужним інструментом метаболізму дрозофіли. Однак цей протокол не є специфічним для дрозофіли і може бути використаний для проведення метаболічних досліджень у будь-яких дрібних безхребетних з невеликими змінами. Незалежно від виду, цей простий метод може бути використаний для відносної кількісної оцінки майже всіх амінокислот, проміжних продуктів у гліколізі та циклі TCA, а також ряду інших малих полярних молекул. У поєднанні з незрівнянними генетичними інструментами, доступними для спільноти дрозофіл, цей тип метаболомічного аналізу ставить муху на перший план метаболічних досліджень в найближчому майбутньому.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.