Подвійне безпосереднє введення крові в цистерну Великої як модель субарахноїдального крововиливу

Резюме

У цьому протоколі ми описали стандартизовану модель субарахноїдального крововиливу (SAH) шляхом подвійного введення аутологічної цільної крові в цистерну magna. Високий ступінь стандартизації процесу подвійного введення являє собою середньо-гостру модель САГ із відносною визначеністю смертності.

введення

Анотація

Вступ

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Всі процедури проводились під наглядом Х. Кастеля відповідно до Французького комітету з етики та керівних принципів Директиви 2010/63/ЄС Європейського Парламенту та Ради щодо захисту тварин, що використовуються в наукових цілях. Цей проект схвалений місцевою CENOMEXA та національними комітетами з етики для досліджень та випробувань на тваринах. Самці мишей C57Bl/6J Rj (Janvier) у віці 8-12 тижнів утримувались у стандартних контрольованих умовах навколишнього середовища: 22 ° C при 1 ° C, 12 годин/12 годин циклу світла/темряви та води та їжі ad libitum.

1. Налаштуйте операцію SAH та підготуйтеся до ін’єкції

Препарат для другої тварини (8-10 тижнів мишей самців C57BL/6J)

3. Індукція SAH

4. Післяопераційне спостереження та закінчення експерименту

  1. Відразу після хірургічного втручання ізолюйте та покладіть мишу з пролежневою виразкою з ковдрою виживання на спину у відкриту коробку під час відновлення.
  2. Щодня зважуйте та спостерігайте за поведінкою кожної миші до жертви (наприклад, D7 після операції).
  3. Значна втрата ваги (> 15% ваги) класично відзначається серед кінцевих точок людини. «Вигнута поза», повільні рухи, прострація, ненормальне формування голосу від травм та/або значна агресивна поведінка - також важливі ознаки страждань тварин. У разі виникнення будь-якого з цих ознак або поєднання ознак спостереження за твариною буде посилено протягом годин після їх появи. Якщо добробут тварини погіршується або не покращується протягом 48 годин, вважається, що досягнуто нестерпних страждань і проводиться евтаназія.
  4. Під час голосування жертвують знеболених мишей шляхом обезголовлення та збирають мозок для подальшого аналізу.
  5. Евтаназія (декапітація) після анестезії ізофлураном (5%).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

SAH спазм судин головного мозку
Як El Amki et al. 22 показано, що базилярна артерія (BA), середня мозкова артерія (MCA) та передня мозкова артерія (ACA) CVS була присутня в моделі SAH шляхом подвійного внутрішньоцистернального введення крові в ACA, MCA або BA від D3 до D10 після операції. Коротко (рис. 2А), після мишної жертви та обезголовлення, мозок збирали і фіксували в 4% параформальдегіді (PFA), а потім заморожували при -80 ° C, перш ніж їх розрізали на 20 м поперечні зрізи кріостатом. Фарбування гематоксиліном та еозином застосовували для ВА (інтрауральний e0,40 мм; Bregma -3,40 мм), MCA (інтрауральний 2,58 mm; Bregma -1,22 мм) та ACA (інтрауральний e4,90 mm; Bregma 1,10 мм), щоб забезпечити можливість ідентифікації CVS за допомогою систематичного запису зображень кольорових стекол за допомогою мікроскопічної камери. Для оцінки відсутності або присутності макроскопічного CVS для кожної пофарбованої артерії розраховували співвідношення площі просвіту до товщини стінки. Чим нижчий коефіцієнт, тим важче CVS. Наприклад, CVS траплявся у BA в мозку SAH порівняно з фіктивним мозком миші (Рисунок 2B), а також в інших великих мозкових артеріях (MCA, ACA, дані не показані 22).

Обговорення

У цьому контексті модель подібна до клінічної фізіопатології SAH щодо ССЗ, асоційованої з SAH. Загалом, CVS виникає через 1 годину у щурів 40 та через 3 дні у мишей 17 у MCA та BA у моделі ендоваскулярної перфорації. На прехіазматичній моделі цистерни для введення крові частота ССЗ була показана між двома днями 49 і вісьмома днями 37 у щурів. У моделі подвійного введення в цистерну магна у щурів CVS розвинувся між 10 хвилинами 29 та 3 днями 31. Ми першими описуємо кінетичний вигляд CVS у миші на моделі SAH подвійним введенням, встановлюємо CVS у головних мозкових артеріях (ACA, MCA та BA) протягом 3 днів і зберігаємо до 10-го дня після SAH 22, близького до цього що спостерігається у пацієнтів із САХ. Ця остання модель може бути визначена як кваліфікована модель SAH, досить суворо без смертності, щоб дозволити вивчення механізмів та терапевтичних засобів, які націлені на CVS.

Іншим неконтрольованим параметром у моделі SAH були можливі коливання середнього артеріального артеріального тиску (MABP), викликані надмірно швидкою процедурою ін'єкції крові 27. Насправді MABP зазвичай різко підвищується після експериментального SAH, щоб підтримувати мозковий перфузійний тиск, а потім падає до вихідного рівня. У моделі SAH ми вводили кров або aCSF (приблизно 10 л/хв) з низькою швидкістю, щоб уникнути цих варіацій MABP. Щодо нейробіологічних подій у цій моделі, що імітують ті, що спостерігаються у людей, ми раніше показали, що модель подвійного введення крові SAH індукує довготривалий CVS, мікротромбоз та пошкодження головного мозку, що пошкоджують мозок, включаючи дефектну параваскулярну дифузію з 3-го по 10-й день після побачив 22. Однак останні дані, що описують, що CSD бере участь у SAI-асоційованому DCI 13, рішуче підтверджують проведення цього типу досліджень у моделі подвійної ін'єкції миші. Це повинно забезпечити наукові досягнення щодо позитивних наслідків нових методів лікування, спрямованих на ЦСД.

На закінчення я хотів би сказати, що подвійне введення цільної артеріальної крові в модель цистерни magna - це освоєна модель, яка забезпечує простий спосіб імітувати фізіопатологію SAH людини, включаючи CVS, мікротромбоз, запалення судин, неврологічний дефіцит і рівень смертності. Він являє собою перевірену модель для випробування нових терапевтичних підходів до лікування смертності, пов'язаної з SAH.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.