Сироваткові лектин-ii-зв’язуючі глікопротеїни глікопаттерну та макукії амурної в

сироваткові

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Зміна глікопаттера в сироватках ASD проти TD
  • Ідентифікація MBG
  • Аналіз MBG генної онтології
  • Аналіз мережі взаємодії білків та шляхів KEGG
  • Налаштування шаблону послідовності MBG
  • Експресія MBG та сіалоглікозилювання в окремих зразках сироватки
  • Обговорення
  • Матеріали і методи
  • Затвердження дослідження
  • Теми
  • Збір та підготовка зразків
  • Лектиновий мікрочип та аналіз даних
  • Мікрочипи сироватки та аналіз даних
  • Виділення та перетравлення МБГ
  • LC-MS/MS аналіз
  • Безмаркетна відносна кількісна оцінка за допомогою розрахунку спектрального індексу
  • Видобуток даних та біоінформатика
  • Мікрочипи лектину/гліко-антитіла та аналіз даних
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Файли Excel
  • Додаткові таблиці
  • коментарі

Теми

  • Порушення спектру аутизму
  • Біомаркери
  • Глікоміки

Анотація

Інструменти протеоміки забезпечують широкомасштабний, автоматизований, заснований на технологіях режим обстеження, який може визначити весь протеом у даній рідині тіла без попереднього припущення про молекули-кандидати 12. Виходячи з цього, було визнано, що загалом п’ять пептидних компонентів, що відповідають чотирьом відомим білкам [аполіпопротеїн (апо) B-100, зв’язаний з фактором комплементу H білок (FHR1), комплемент C1q та фібронектин 1 (FN1)], виявляються більш важливими для аутизму проти команд 13. Три піки потенційних біомаркерів показали співвідношення m/z приблизно 4, 40, 5, 15 та 10, 38 кДа, що суттєво диференціювало зразок TSA від контрольної групи при аналізі цілих білків, а не пептидів після перетравлення триптихом 14 .

Повнорозмірне зображення

Результати

Зміна глікопаттера в сироватках ASD проти TD

Структура мікрочипів лектину та отриманих глікопротеїдів сироваткових глікопротеїнів, визначених мікрочипами для груп ASD та TD, показана на рис. 2A, B. Вихідні дані були імпортовані в EXPANDER 6.0 для ієрархічного кластерного аналізу (рис. 2C). Нормалізовані інтенсивності флуоресценції (NFI) та особливості зв’язування цукру для кожного з 37 лектинів двох груп наведені в таблиці S1. В результаті диференціального аналізу п'ять лектинів продемонстрували значні відмінності між групами ASD та ASD. MAL-II (Siaα2-3 Gal/GalNAc) та MAL-I (Siaα2-3Galβ-1, 4GlcNAc та Galβ-1, 4GlcNAc) представили найбільш суттєво підвищений NFI (коефіцієнт варіації = 3, 33 та 2, 20, p

( AT ) Розміщення мікрочипа лектину. ( ) Зображення мічених Cy3 сироваткових білків від TD та ASD, пов'язаних з лектиновими чіпами. Флуоресцентні зображення сканували за допомогою 70% -ної помножувальної трубки та 100% налаштувань потужності лазера в конфокальному сканері Genepix 40 00B. Показана частина слайда з трьома повтореними таблицями лектину. Лектини показали значні відмінності, позначені білими коробочками. ( VS ) Ієрархічний класифікаційний аналіз NFI для 37 лектинів TD-1

5. Зразки наведені у стовпцях, а лектини - у рядках. Колір та інтенсивність кожного квадрата вказують на рівні вираження щодо інших даних у рядку. Червоний, високий; зелений, низький; чорний, середній. Жовтий та синій ящики вказують на вищу та нижчу інтенсивність зв’язування лектину в TSA порівняно з TD сироватками. ( D ) Диференціальний аналіз NFI для п’яти лектинів TD-1

Повнорозмірне зображення

Аналіз MBG генної онтології

Аналіз мережі взаємодії білків та шляхів KEGG

Загалом 184 ідентифікованих MBG були прокоментовані в DAVID Bioinformatics Resources (версія 6.7). Ці MBG були зіставлені на 6 смугах KEGG з порогами підрахунку ≥5 та визначено значення p 30 (додатковий малюнок S1). Порівнювали частоти амінокислот, специфічні для положення оточуючих залишків аспарагіну (13 амінокислот на обох кінцях), і шаблон [AVH] [KR] xNxxNxSxxxY (де "x" позначає будь-який залишок, [AVH] і [KR] являє собою кілька амінокислотних залишків, які можуть з'явитися на місці, і точка кулі вказує на можливий глікозит) були визначені як можлива закономірність N-глікозилювання навколо аспарагіну (рис. 3G). Цікаво, що мотиви xxxxxxQSDxxYK та xxxxxxHHGSxSGx були значно надмірно представлені (збільшення = 81, 62 та 67, 07) у даних MBG (рис. 3G), що могло представляти 0-зв’язані мотиви глікозилювання навколо залишків серину для глікопептидного домену пов'язаний з α2-3. Однак для подальшого підтвердження О-глікозитів у МБГ, як і раніше, необхідні подальші дослідження.

Експресія MBG та сіалоглікозилювання в окремих зразках сироватки

Вестерн-блот проводили для перевірки експресії C8B, серотрансферину (TF), C1QA та APOD в окремих зразках сироватки. Як результат, експресія C8B та TF була збільшена, а експресія C1Q зменшена у чотирьох випробуваних зразках TSA порівняно з чотирма зразками TD, що відповідало результатам MS (малюнок 4A). Однак експресія APOD не суттєво відрізнялася між зразками TD та ASD (рис. 4А). LGAM були розроблені для виявлення α2-3-пов'язаного сиалогікозилювання C8B, TF, C1QA та APOD у 15 окремих зразках сироватки від TD та 15 ASD (рис. 4B). Відповідно, між двома групами не було виявлено суттєвої різниці між сиалоглікозилюванням C8B, TF та C1QA. Однак α2-3-сиологікозилювання APOD було значно збільшено у зразках TSA порівняно із зразками TD (p = 0,004) (рис. 4C). Аналіз кривої ROC показав, що сироваткові рівні сиалогікозильованого α2-3 APOD давали AUC 0,88 зі специфічністю 86,7% та чутливістю 80,6% для диференціації ASD від TD (фігура 4D).

( AT ) Вестерн-блот-аналіз експресії C8B, TF, C1QA та APOD у чотирьох зразках сироватки TD та чотирьох ASD. ( ) Оцифровані зображення, отримані з LGAM для сироватки TD і ASD. ( VS ) Аналіз інтенсивності зв'язування для C8B, TF, C1QA та APOD 30-ти випадків TD та ASD у сироватці крові за допомогою LGAM. Смужки помилок представляють 95% довірчі інтервали для засобів. Статистично значущі відмінності між групами позначаються значеннями P. Аналіз кривої ( D ) Сіалогікозильований α2-3 APOD ROC для диференціації зразків ASD від зразків TD.

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Загалом, сіалова кислота знаходиться в якості компонента олігосахаридних ланцюгів муцинів, глікопротеїнів та гліколіпідів, що займають невідновні кінцеві позиції N- або O-гліканів. Рівень сіалової кислоти в сироватці крові пов’язаний із захворюваннями печінки 46, ревматичними захворюваннями 47 та діабетом 2 типу 48. У цьому дослідженні Вестерн-блот-аналіз підтвердив зміну експресії C8B, TF та C1QA, але не експресії APOD, в окремих зразках сироватки ASD та TD (рис. 4А). LGAM виявили значне збільшення експресії α2-3 сиалогікозилюючого APOD в окремих зразках сироватки ASD, що значною мірою пояснює відсутність різниці в експресії білка APOD між сироватками ASD і TD і підкреслює, що MBG та їх α2-3 сіалогіколізація пов'язані з ADS . . Аналіз кривої ROC показав, що сіалоглікозильований APOD може чутливо і специфічно відрізнити ASD від дітей з TD як біомаркери-кандидати (AUC = 0,88), і показав важливість та необхідність дослідження зміни глікозилювання глікопротеїдів у сироватках для діагностики ASD.

На закінчення висловлювання експресії α2-3 сиалозил-Т антигенів було значно збільшено в сироватках TSA порівняно з TD. Загалом у сироватках TD та ASD було ідентифіковано 194 та 217 MBG, з них 74 білки були спеціально ідентифіковані або підвищені в сироватках ASD. Біоінформатичний аналіз показав, що аномальний каскад комплементу та аномальна клітинна регуляція стимульної реакції можуть бути новими виробниками або маркерами АСД, забезпечуючи нову інформацію для подальшого дослідження патогенезу АСД. Що ще більш важливо, LGAM виявили значне збільшення експресії α2-3 сиалогікозилювання APOD в окремих зразках сироватки TSA, що може служити потенційними біомаркерами для діагностики АСД.

Матеріали і методи

Затвердження дослідження

Представлені тут збір та використання всіх зразків патології людини для дослідницьких цілей були схвалені Комітетом з етики Північно-Західного університету, Народної лікарні провінції Шеньсі та Четвертого військово-медичного університету (Сіань, Китай). Учасники отримали письмову інформовану згоду на збір їх слини та сироватки. Це дослідження було проведено відповідно до етичних вказівок Гельсінкської декларації.

Теми

Повний розмір таблиці

Схвалення цього дослідження отримано від Комітету з питань етики та Комітету з вивчення людських питань університету Сіань Цзяотун (Сіань, Китай). Усі батьки учасників дослідження надали письмову інформовану згоду. Всі експерименти проводились згідно затверджених рекомендацій.

Збір та підготовка зразків

Усі проби крові відібрала педіатрична медсестра та венозну кров. Кров давали згортатися при кімнатній температурі протягом 25 хв. Потім згусток видаляли центрифугуванням при 1500 xg протягом 10 хвилин у холодильній центрифузі. Отриманий супернатант негайно переносять у чисту поліпропіленову пробірку, доповнену коктейлем інгібіторів без ЕДТА (інгібітор зупинки протеази; Thermo Scientific Protein Research Products Pierce, Рокфорд, Іллінойс, США) при сироватковій концентрації 10 мкл/мл. Вироблену сироватку аликвотували невеликими порціями і негайно заморожували на сухому льоду і зберігали при -80 ° C. Для нормалізації відмінностей між суб'єктами та перенесення індивідуальних варіацій 50 мкл 50 зразків сироватки з груп TD та ASD групували відповідно, виявлення мікрочипів лектину та виявлення LC-MS/MS. Інші 15 зразків з кожної групи зберігались окремо для подальшої перевірки.

Лектиновий мікрочип та аналіз даних

Мікрочип лектину отримували та інкубували із міченими флуоресцентним барвником Cy3 сироватковими білками (GE Healthcare) згідно з нашим попереднім протоколом 50, 51, 52, 53, який детально описаний у Додаткових матеріалах та методах. Для виявлення мікрочипів лектину використовували 50 зразків сироватки TD та 50 зразків ASD. Двадцять мікролітрів (20 мкл) кожного зразка і 10 зразків з пулу були підготовлені для формування підгруп TD-1

5. Отримані зображення аналізували при 532 нм для виявлення Cy3 за допомогою програмного забезпечення Genepix 3.0. Середнє тло віднімали, а значення, менше середнього значення ± 2 стандартних відхилення (SD), придушували з кожної точки даних. Медіана ефективної точки даних для кожного лектину була загально нормована до суми медіани всіх ефективних точок даних для кожного лектину в блоці. Кожну пробу спостерігали послідовно з трьома повторними слайдами, і нормували медіану кожного лектину з 9 повторних блоків, усереднювали і визначали SD. Нормалізовані дані для груп TD та ASD порівнювали згідно з наступними критеріями: зміна кратності ≥1,5 або ≤0,67 вказувала на регулювання вгору або вниз. Відмінності між двома довільними наборами даних перевіряли t-тестом спареного студента за допомогою статистики SPSS 19. Вихідні дані додатково аналізували за допомогою Expander 6.0 (//acgt.cs.tau.ac.il/expander/) для виконання ієрархічної кластеризації аналіз.

Мікрочипи сироватки та аналіз даних

Мікрочипи сироватки отримували, використовуючи 30 окремих зразків сироватки від 15 дітей TD та 15 ASD кожна. Мічений Cy3 MAL-II застосовувався для виявлення специфічної структури цукру в мінімальній кількості зразків сироватки, які іммобілізовані на предметних стеклах, згідно з протоколом виготовлення мікрочипів слини 51 з деякими модифікаціями. Детальна інформація міститься у додаткових матеріалах та методах.

Виділення та перетравлення МБГ

Кон'югати магнітних частинок MAL-II (MMPC) отримували, як описано 54, 55. Два міліграми (

30 мкл (виміряно реактивом Бредфорда) білка з об'єднаних сироваток TD і ASD інкубували з MMPC 54, 55. Отримані глікопротеїни (близько 150 мкг) перетравлювали трипсином та PNGase F, як описано раніше 54, 55, 56. Детальна інформація міститься у додаткових матеріалах та методах.

LC-MS/MS аналіз

Аналіз МС проводили за допомогою мас-спектрометра LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Детальні параметри, використані в цьому експерименті, наводяться в додаткових матеріалах та методах. Вихідні дані обробляли за допомогою Proteome Discoverer (версія 1.4.0.288, Thermo Fischer Scientific). Спектри MS/MS шукали за допомогою механізму SEQUEST щодо повної бази даних протеомів UniProt та бази даних забруднень (Випуск 2013_06, 88913 Білкові послідовності). Пошук проводили з такими параметрами: допуск маси попередника 20 ppm; Допуск маси MS/MS 0,6 Da; два пропущені розщеплення триптичних пептидів; змінні модифікації окислення (M), метилтіо (C), пептидні спектральні сірники (PSM) були перевірені за допомогою цільового пошуку в базі даних манок (FDR ≤ 0,01).

Безмаркетна відносна кількісна оцінка за допомогою розрахунку спектрального індексу

Після ідентифікації пептидів було застосовано алгоритм, подібний до ProteinExtractor у ProteinScape, який використовує заданий мінімальний бал пептидів (minPepScore) та мінімальну кількість пептидів на білок (minNrPeps), як описано 57. Серед перелічених білків екстрагували кожен збіг пептидного спектру (PSM). Спектральний індекс (SI) на основі спектрального та пептидного підрахунків розраховували, як описано раніше 58. Кількість необроблених спектральних показників для ідентифікованих білків нормалізували, використовуючи наступні формули (Формула 1 і Формула 2):

де C i - загальна спектральна кількість циклу i; і є усередненим загальним спектральним рахунком усіх пробігів, що порівнюються; N i та R i - нормалізована та необроблена спектральна кількість білка у пробігу i, відповідно. SI,/C i, використовувався для нормалізації загального спектрального підрахунку кожного циклу для зменшення варіабельності циклу до циклу.

Видобуток даних та біоінформатика

Аналіз даних та професійні програмні засоби, що використовуються у цьому дослідженні, докладно описані в Додаткових матеріалах та методах.

Мікрочипи лектину/гліко-антитіла та аналіз даних

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Цінь, Ю. та ін. Глікопаттер сироватки та зв'язування глікопротеїдів лектину-II з лектином Maackia amurensis при розладі спектру аутизму. Наук. Респ. 7, 46041; doi: 10.1038/srep46041 (2017).

Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог в опублікованих картах та приналежності до інституцій.