Тандемна рідинна хроматографія; Підхід до мас - спектрометрії для аналізу метаболітів

Резюме

Тут ми описуємо протокол вилучення метаболітів із золотистого стафілокока та їх подальший аналіз за допомогою рідинної хроматографії та мас-спектрометрії.

Анотація

Вступ

Збудники бактерій стикаються з багатьма проблемами в середовищі перебування. На додаток до прямої атаки імунних клітин, господар також виділяє поживні речовини, важливі для виживання та реплікації бактерій, створюючи харчовий імунітет 1, 2. Щоб вижити в цих ворожих середовищах, бактеріальні збудники реалізують фактори вірулентності. Деякі з цих факторів можна використовувати для уникнення імунної відповіді бактерій; Іншими факторами є такі травні ферменти, як гіалуронідаза, термонуклеаза та ліпаза, які дозволяють бактеріям поповнювати поживні речовини, споживаючи тканинні компоненти 3, 4, 5. Дійсно, бактерії розробили регуляторні системи, які пов'язують фізіологічний стан клітини з виробленням факторів вірулентності 6, 7, вгору> 8, 9, 10.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Приготування буферних розчинів

  1. Приготуйте забуференний фосфатом сольовий розчин (PBS; рН 7,4), розводячи вихідний розчин 10 × PBS до кінцевої концентрації 1x надчистою водою (дистильованою та деіонізованою).
  2. Приготуйте гартувальний розчин, поєднавши 2 мл ацетонітрилу, 2 мл метанолу, 1 мл надчистого H 2 O і 19 мкл (0,1 мМ кінцевої концентрації) мурашиної кислоти.
  3. Готують LC-MS розчинник А, додаючи мурашину кислоту (0,2% [об./Об.] Кінцевої концентрації) до надчистої води.
  4. Готують LC-MS розчинник B, додаючи мурашину кислоту (0,2% [об./Об.] Кінцева концентрація) до ацетонітрилу.
    ПРИМІТКА: Усі розчини повинні бути виготовлені з реагентами найвищої чистоти (зазвичай сорт ВИСОКОЇ ЕФЕКТИВНОСТІ РІДКОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ). Розчини слід готувати щойно перед кожним експериментом і зберігати на льоду перед використанням.

2. Встановлення стаціонарного росту S. aureus

  1. Streak S. aureus, що представляє інтерес для виділення на триптичному соєвому агарі (TSA) із замороженого розчину гліцерину. Інкубуйте при температурі 37 ° C протягом 16-24 год.
  2. Інокулюйте 4 мл триптичного соєвого відвару (ТСБ) або іншого відповідного середовища в стерильні скляні інкубаційні пробірки з окремими колоніями кожного штаму. Інкубувати похило (

70 °) з обертанням при 60 обертах на хвилину (об/хв) при 37 ° C протягом 16-20 год.
ПРИМІТКА: Культури протягом ночі схильні до градієнтів кисню, якщо стандартні процедури, включаючи описані в кроці 2.2, впливають на клітинну фізіологію. Отже, ми використовуємо стратегію багаторазового зворотного розведення для забезпечення стабільного біологічного стану (див. Кроки 2.4-3.2 нижче).

  • Використовуйте спектрофотометр для вимірювання оптичної щільності культур із етапу 2.2 при 600 нм (OD 600). Використовуйте стерильне середовище як оптичний еталон (порожнє). Ці клітини розводять до OD 600 0,05 у 50 мл стерильному середовищі TSB (попередньо нагрітому до 37 ° C) в окремих пляшках DeLong по 250 мл.
  • Інкубіруйте культури при температурі 37 ° С на водяній бані при 280 обертах на хвилину при струшуванні.
  • Кожні 30 хв проводити вимірювання OD 600; у міру збільшення оптичної щільності може знадобитися розбавляти культури TSB так, щоб вони залишалися в лінійному діапазоні поглинання спектрометра.
  • Якщо культури зі стадії 2.5 мають OD 600

    Досягайте 0,8-1,0, пересівайте їх у 50 мл 37 ° C на TSB до OD600 0,01-0,05 і повторіть кроки 2,4 і 2,5.

    0,4-0,5, за допомогою серологічної піпетки видаліть 13 мл культури з колби і нанесіть зразок на фільтри.

  • Після фільтрування всієї проби негайно змийте фільтр ≥5 мл крижаних метаболітів, пов'язаних із середовищем PBS.
  • Звільніть вакуум і за допомогою пари стерильних щипців вийміть фільтр із фритти. Переверніть фільтр (стороною комірки вниз) у попередньо охолодженому розчині гарту.
    ПРИМІТКА: Важливо виконувати вищезазначені дії швидко (тобто протягом декількох секунд) і так само швидко, як рідина для забезпечення швидкого стримування клітин була видалена, зупиняючи метаболічну активність.
  • Інкубуйте фільтри в гартувальному розчині на сухому льоду протягом ≥20 хв.
  • За допомогою стерильних щипців переверніть фільтри (клітиною догори) в чашці Петрі і за допомогою мікропіпетки загасіть клітини в гартувальному розчині, щоб змити мембрану.
  • ресуспендують клітини в гартувальному розчині, а потім переносять суспензію клітин у стерильну 2 мл ударостійку пробірку

    100 мкм Л 0,1 мм діоксиду кремнію. Зберігайте це на сухому льоду або при -80 ° C.

    1. Розморозити зразки на мокрому льоду і помістити клітини в гомогенізатор з чотирма сплесками на 30 с при 6000 обертів на хвилину, причому 2 хвилини періодів охолодження на сухому льоду заважають циклам.
    2. Прояснити лізати протягом 15 хвилин у попередньо охолодженій охолодженій мікроцентрифузі з максимальною швидкістю (тобто 18 213 xg при ≤4 ° C).
    3. Переносять супернатант в чисту реакційну пробірку.
    4. За допомогою мікропіпетки перенесіть невелику частину зразка в пробірку для мікроцентрифуги для визначення залишкового вмісту пептиду на етапі 6; Решту збережіть при -80 ° C.
      ПРИМІТКА: Обсяг зарезервованого зразка буде змінюватися залежно від аналізу BCA на кроці 6.1. Цей зразок слід зберігати на мокрому льоду для негайного аналізу або заморожувати при -80 ° C.

    6. Аналіз на біцинхонінову кислоту (BCA)

    1. Виконайте аналіз BCA, як рекомендує виробник набору, використовуючи зразки з кроку 5.4 для визначення залишкової концентрації пептиду для кожного зразка.

    8. Пакетна корекція кількості іонів

    1. Позначте кожен зразок, який буде служити еталонним зразком для корекції партії (наприклад, дикий тип, копія 1).
    2. Обчисліть суму кількості іонів для всіх метаболітів у контрольній пробі. Повторіть цей розрахунок для всіх зразків.
    3. Поділіть загальне іонне число кожного зразка на загальне іонне число еталонного зразка, щоб створити співвідношення.
    4. Розділіть іонне число кожного метаболіту у зразку на співвідношення проба/еталон, щоб отримати іонне число для кожного метаболіту з виправленням.

    1. Розділіть кількість скоригованих іонів для кожного зразка, отриманого на етапі 8, на концентрацію пептиду, визначену за допомогою аналізу BCA на етапі 6, щоб отримати нормоване значення для кожного метаболіту.
      ПРИМІТКА: Нормалізовану, періодично скориговану кількість коригуваних іонів для кожного метаболіту на етапі 9.1 можна порівняти безпосередньо між штамами та статистичним аналізом (наприклад, тест Манна-Уітні U). З іншого боку, відомо, що метаболіт може бути незмінним або за допомогою лікування, або генетичний фон може бути використаний як пристрій для нормалізації для виявлення змін при розкладанні метаболіту. Включення відомої кількості L-норваліну або глурарової кислоти в буфер екстракції може бути використано для виправлення втрат під час обробки зразків 34.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Ми проаналізували внутрішньоклітинні пули метаболічних продуктів у S. aureus під час росту in vitro в багатому комплексному середовищі. Як доказ принципу ми порівняли метаболітні профілі між чутливим до метициліну остеомієлітом S. aureus, виділеним UAMS-1 (дикий тип [WT]), та ізогенним штамом, якому бракує глобального регулятора транскрипції CodY (Δ codY) 26. Стаціонарні експоненційні культури штамів WT та codY встановлювали в середовищі TSB, як описано на кроці 2 протоколу. Поведінка росту дикого типу та мутантних культур codY-null була однаковою, лише з незначними різницями у врожайності та швидкості росту (Ілюстрація 1). Використовуючи РНК-Seq та технологію мікрочипів, ми та інші гени, відповідальні за ферменти, що беруть участь у біосинтезі амінокислот, отриманих з аспартату, були депресовані в мутованому c-null codY порівняно з клітинами WT протягом - vitro - зростання рівня TSB (Малюнок 2) 25, 27, 30. Крім того, 30, 35 і brnQ1 та brnQ2, пермеази для амінокислот з розгалуженим ланцюгом, надмірно експресуються в нульовому мутанті codY.

    Щоб визначити, наскільки стійкий внутрішньоклітинний вміст метаболітів пов'язаний із цим шляхом, зміненим у нульовому мутанті, ми проводимо профілювання метаболітів на основі LC-MS. Мутантні клітини WT та codY-нульові вирощували до біологічного стійкого стану та сканували, як описано на кроці 4 протоколу. Ми визначали кількість метаболіту через пікову інтенсивність іонів для кожної інтеграції метаболітів з хроматографічно розв’язаним використанням аналітичного програмного пакету (див. Технічний документ). Ми виправили відмінності в біомасі, нормалізованій за вмістом метаболітів у залишковій концентрації пептидів у кожному зразку. Ми також виправили ці значення для можливих періодичних ефектів між зразками в кожній пробі для всіх метаболітів, щоб розрахувати середнє іонне число та використовувати зразок дикого типу як еталонне значення. Цей підхід дозволив порівняти між зразками вміст метаболітів за різними умовами. Порівняння між метаболітами в даному зразку можна здійснити подібним чином, спочатку нормалізуючи вміст метаболітів за кількістю іонів, використовуючи метод стандартного додавання молярних кількостей.

    Ми порівняли рівень ключових проміжних сполук у шляху аспартату в UAMS-1 та його кодового нульового мутанта. Як і в 3 Як бачимо, кінцеві продукти цього шляху (наприклад, треонін та (ізо) -лейцин) містять багато кодових мутантних клітин, тоді як попередники (наприклад, аспартат та оцетиловий гомосерин) містять у клітинах ВТ. Комбінована регуляція BrnQ пронизує 36 та біосинтетичний шлях ILV, ймовірно, призводить до збільшення рівня ізолейцину та лейцину 30. Хоча відмінності відносно невеликі (29, визначені за допомогою аналізу RNA-Seq, слід також зазначити. DHP, 2,6-діаміногептандіоат ( 2,6-діамінопімелат).

    тандемна
    Малюнок 3: Частота метаболітів в аспартаті - Сім'я змінюється за допомогою кодового мутанта. Показані журнальні 2-кратні зміни вибраних метаболітів у нульовому мутанті codY порівняно з UAMS-1 (WT). Зміна була визначена діленням середньої частоти трьох повторностей нульового кодуY біологічного штаму на середню чисельність трьох біологічних повторень штаму WT. Стандартною помилкою між біологічними повторностями для кожного метаболіту була необхідність передплати. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    1,0, розведений назад до OD 600 о

    0,05, вирощують і збирають, коли вони мають OD 600

    0,5 досягнуто. Така процедура також розріджує молекули цитоплазми, включаючи стабільні РНК, накопичуючи ріст за ніч. Дійсно, РНКIII, ефектор системи сприйняття agr кворуму, є однією з таких РНК і регулює експресію тих самих генних мішеней, що і CodY 25, 43, 44. Кумулятивна РНКIII може маскувати залежну від CodY регуляцію, що призводить до недооцінки сили Репресія або стимуляція CodY (Шарма та Брінсмейд, неопубліковані результати).

    Одне обмеження цього аналізу полягає в тому, що він дає миттєву уявлення про кількість продуктів метаболізму в клітині; з результатів не можна зробити висновків щодо змін потоку через певний шлях. Наприклад, кількість лізину та метіоніну між двома досліджуваними штамами не може змінитися, незважаючи на дерепресію біосинтетичних ферментів у зоні codY-zero (2 і 3). CodY-нульовий штам насправді може виробляти більше лізину та метіоніну, але їх можна швидко перетворити в інші сполуки; щоб ці молекули не накопичувались. Використання 13 C або 15 N мічених джерел вуглецю або азоту дозволило б нам слідувати за каркасами вуглецю та азоту через основні метаболічні коридори 45, 46.

    Ми використовували описаний метод для пояснення змін у пулах метаболітів у S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47 та Enterococcus faecium 48, однак метод можна застосовувати до інших грампозитивних та грамнегативних бактерій, включаючи інші патогени людини. легко культивується в лабораторії. Справді, несподівані зв’язки між метаболізмом та вірулентністю можуть свідчити про метаболомічну та транскриптомічну інтеграцію інформації, яка може призвести до нових стратегій лікування інфекцій.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автори заявляють, що не мають фінансових інтересів.