Техніка оклюзії середньої мозкової артерії для індукування післяінсультної депресії у щурів

Резюме

Тут ми представляємо протокол для індукції післяінсультної депресії у щурів, виключаючи середню мозкову артерію через внутрішню сонну артерію. Ми використовуємо тест на примусове плавання Porsolt та тест на перевагу сахарози для підтвердження та оцінки викликаних депресивних настроїв.

Анотація

Вступ

Інсульт посідає четверте місце у списку смертоносних захворювань у Сполучених Штатах з 1, 2, 3, тоді як він викликає найбільше інвалідності серед дорослих у розвинених країнах 4; Це робить інсульт провідним суперником серед найбільших проблем зі здоров'ям у світі. Нормальність виживання конвертів рідкісна: близько 15% -40% тих, хто вижив, страждають на стійку втрату працездатності, 20% потребують інституційного догляду через 3 місяці після інсульту 5, а приблизно третина шестимісячних тих, хто вижив, також потребують інших, щоб допомогти їм Життя. Через кожен день 6. Вважається, що інсульт також відповідає за збільшення національних витрат на охорону здоров'я 7. Американська кардіологічна асоціація оцінює, що витрати, пов’язані з конкретними випадками, у Сполучених Штатах перевищують 50 мільярдів доларів у 2010 році 8 .

Інсульт не тільки завдає довгострокової шкоди, але деякі ті, хто вижив, схильні до емоційних та поведінкових розладів, таких як деменція, втома, тривога, депресія, марення та агресія 9, 10, 11, 12, 13, 14. Психологічним продовженням після інсульту є діагностика після інсульту (ПСД), яка діагностується приблизно у 40% -50% тих, хто вижив 15, 16, 17. Індукована інсультом призводить до збільшення захворюваності та смертності 18, 19, 20, 21, 22. Патофізіологія ПСД до кінця не вивчена, але, як видається, вона зумовлена ​​кількома факторами і пов’язана з інвалідністю, когнітивними порушеннями та ураженнями в місці 23.

Модель фокальної ішемії мозку щурів, створена MCAO, є найбільш широко використовуваною твариною моделлю інсульту 24, 25, 26, 27. Демонстрація введення PSD щурам через оклюзію MCA через ICA використовує методи, що мінімізують смертність та мінливість у моделі MCAO.

Основною метою цього протоколу є окреслення етапів стимулювання PSD у щурів шляхом виключення MCA за допомогою ICA, модифікованої моделі MCAO, яка зменшує смертність та результат мінливості 28. Конкретні цілі включають проведення неврологічних та гістологічних досліджень (визначення числа неврологічного фокусу [NSS], обсягу зони інфаркту та набряку мозку) для перевірки ефективності MCAO та використання поведінкових тестів для визначення впливу цієї процедури MCAO на Розвиток емоційних розладів, особливо PSD.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Комітет з догляду за тваринами Університету Бен-Гуріона в Негеві, Ізраїль, затвердив усі процедури лікування та тестування, що використовуються в цьому протоколі.

1. Підготуйте щурів до передпроцедурної презентації

СОРТ: Вибирайте дорослих самців щурів Sprague-Dawley вагою 300-350 г.

  1. Щури, по чотири в клітці, у віварії при 22 ° C і вологості 40%, із зворотним циклом 12 годин світло/темрява (світло з 8:00 ранку) та необмеженим доступом до їжі та води.
  2. Випадковим чином розподіляють щурів на дві групи, а саме групу MCAO (N = 24) та лобкову групу (N = 19).

2. Підготувати щурів до операції

3. Хірургія (методика MCAO)

СОРТ: Виконайте операцію, як описано Бойком та співавт. 28 та використовувати інструменти McGarry et al. 29 та Uluç та ін. 30 .

  1. Проведіть вентральну серединну лінію та розсічіть поверхневу фасцію.
  2. Обережно зробіть різке та тупе відділення між трьома трикутними м’язами (грудниноподібні, двошлункові та грудинно-соскоподібні м’язи) для виявлення сонних артерій (ЕКА, ВСА та загальної сонної артерії [CCA]).
  3. Акуратно розберіть та виставте правильні CCA та ICA.
  4. Відокремте праві CCA та ICA від блукаючого нерва.
    СОРТ: При ідентифікації сонних артерій, як визначено на кроці 3.2, ICA буде визнано половиною відділень CCA поряд з ECA.
  5. Вставте катетер (термотравлене або силіконове покриття 4-0 нейлону) безпосередньо через ICA,

  1. Державні службовці дають 5 мл 0,9% сольового розчину внутрішньочеревно для кожного щура, відразу після операції, щоб запобігти зневодненню.
  2. Вводити знеболюючі препарати безумовно в перший день після операції; Використовуйте мелоксикам 1 мг/кг SQ q24 год. Давайте розведений дипірон (0,5 г, розчинений у 400 мл питної води) щурам, які проявляють симптоми болю протягом перших 3 днів.
  3. Жертви щурів із судомами (судоми викликані підвищеним внутрішньочерепним тиском через набряк мозку або мозковий крововилив 28).

5. Оцінка неврологічної важкості 31

СОРТ: Цю процедуру виконують два спостерігачі, які не беруть участі в хірургічній процедурі; Вони перевіряють неврологічний дефіцит та ступінь рухового дефіциту на загальний бал 0-4 32. Цей бал можна оцінювати через різні часові інтервали; У цьому іспиті це було зроблено через 50 хвилин, 24 години, 7, 15 та 30 днів після операції. Ось кроки для оцінки NSS. Хоча в цій ситуації немає необхідності, цей показник необхідний для визначення інсульту гризунів для призначення лікування.

  1. Покладіть щура на керамічну підлогу і дайте їй вільно кочувати протягом 1 хвилини.
  2. Акуратно потягніть щура за хвіст і хвилюєтесь так.
    1. Оцінюйте щура з оцінкою 0 за відсутність неврологічних дефіцитів.
    2. Клас щура оцінюється 1 балом за переднє згинання.
    3. Сортуйте щура з оцінкою 2 для контралатеральної слабкої передньої ноги.
    4. Підрахуйте щура оцінкою 3 для циркуляції з боку геміплегіки, коли його тягнуть за хвіст.
    5. Передайте щуру оцінку 4 за спонтанне кружляння 32.
      СОРТ: Якщо спостерігається більше однієї з відповідей, перевага надається дії з вищим балом.

6. Визначення об'єму інфаркту (гістологічне дослідження)

7. Вимірювання набряку мозку 38

СОРТ: Набряк мозку вимірювали через 24 години після останнього MCAO. Евтаназія тварин з важким неврологічним дефіцитом, що заважає їсти та пити принаймні три дні, втрата ваги понад 20%, геміплегія або судоми.

  1. Оцініть розмір набряку правої півкулі, використовуючи компіляцію частково нарізаних ділянок для обчислення обсягів правої та лівої півкуль у довільних одиницях (пікселях).
    СОРТ: Для цього розрахунку використовуйте програмне забезпечення ImageJ 1.37v після оптичного сканування (роздільна здатність: 1600 x 1600 dpi). Виберіть цікаву область та скористайтеся функцією вимірювання в меню аналізу. У нашому розслідуванні використовувались макроси.
  2. Виражають область мозку, як правило, набряк у відсотках від стандартних ділянок у неушкодженій контралатеральній півкулі.
  3. Обчисліть ступінь набухання за допомогою рівняння 39, розробленого раніше .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Гістологічні дані (Таблиця 1) показали статистично значущий об’єм інфаркту у відсотках від загального мозку порівняно з тваринами в лобковій контрольній групі (p Рисунок 2A) і мав більш тривалий період нерухомості (p Рисунок 2B). У порівнянні з лобковими щурами.

техніка
Рисунок 1: Графічна демонстрація часової шкали журналу. Різні тести, які проводяться на щурах у різний час, можна побачити на схемі: MCAO = середня оклюзія мозкової артерії на початку експерименту; NSS = число неврологічного фокусу, 50 хв, 24 години та 7 та 30 днів після MCAO; І тести поведінки (переваги сахарози та тести примусового плавання за Порсольтом) з 30 по 33 день після MCAO. Ця цифра взята з Ifergane та співавт. 45 змінено. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

техніка
Малюнок 2: Тест на перевагу Сукро, проведений з 30 по 33 день з пост-MCAO (n = 16) та лобковими контрольними щурами (n = 14). Частка (%) сахарози. Щури MCAO споживали менше сахарози (стор. Клацніть тут, щоб побачити більшу версію цього малюнка.

мозкової
Малюнок 3: Випробування Порсольта на примусове плавання з 30 по 33 день після MCAO (n = 16) та після фіктивних процедур (n = 14). Тривалість руху (у секундах). Час нерухомості в тесті вимушеного плавання був значно більшим у групі MCAO, ніж у групі Sham (стор. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити більшу версію цього малюнка.

Історичні результати Близька група оклюзії мозкової артерії Присоромлена група
Весь мозок (обсяг інфаркту) 8,8% ± 6,5 0,3% ± 0,1
Гема мозку 10,2% ± 4,6 2,6% ± 1,2
Усі дані представляють групу ± S.E.M.

Таблиця 1: Гістологічні дані щодо об’єму інфаркту та набряку мозку. MCAO = оклюзія середньої мозкової артерії (n = 5); Квиток (n = 5).

Неврологічний фокус Близька група оклюзії мозкової артерії Присоромлена група
Через 50 хвилин після операції 2,75 ± 0,14 0,0 ± 0,0
Через 24 години після операції 3,2 ± 0,15 0,0 ± 0,0
Через 7 днів після операції 0,91 ± 0,2 0,0 ± 0,0
Усі дані представляють групу ± S.E.M.

Таблиця 2: Неврологічне фокусне число (NSS) для MCAO та лобних щурів. MCAO = оклюзія середньої мозкової артерії (n = 16); Квиток (n = 14). Ця таблиця походить від Ifergane et al. 45.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Один із способів представленої тут методики MCAO можна розглядати як більш безпечну, ніж оригінальна модель MCAO, показаний не впливаючи на ECA та її гілки, включаючи потиличну артерію, кінцеві язики та верхньощелепну артерію. При закритті MCA над ICA. Відмова від ЕКА (та її гілок) оригінальною моделлю MCAO, через дистальне відділення та коагуляцію 46, спричиняє порушення мастифікації, оскільки судинне постачання м’язів пошкоджене. 47 Руйнування м'яза може врешті-решт спричинити вивільнення додаткової обчислювальної динаміки рідини. На відміну від оригінальної методики MCAO, при якій доступ до MCA здійснюється через ECA, описана тут методика модифікована для інсульту без переривання кровотоку в ECA та її притоках.

Основні аргументи на користь нової моделі MCAO порівняно з оригінальною моделлю MCAO полягають у її здатності суттєво зменшити мінливість набряку мозку, змін обсягу та ваги інфаркту, а також зменшити залежність від MCAO смертності. Смертність у процедурі MCAO є важливим фактором 48; Рівень смертності 20 відсотків вважається розумним 49,50. Рівень смертності (20% для оригінального MCAO, 12,5% для нового MCAO та 0% для контролю) у поточному дослідженні знаходився у прийнятному діапазоні, але нова техніка MCAO мала кращі результати, ніж оригінальна MCAO.

Щури, яким піддавали нову процедуру MCAO, втрачали вагу відразу після операції та набирали більше ваги в кінці дослідження, ніж щури, яким застосовували оригінальну методику MCAO 28. Більша втрата ваги та менший приріст ваги у щурів, яким піддавали первинному MCAO, можуть бути наслідком впливу ЕКА на зв’язки під час операції, що призведе до дистальної гіпоперфузії на лицьовій, мовленнєвій та нижньощелепній артеріях, а також пошкодження м’язів від ішемічної підтримки Мастика. Коли мастирування порушено, пероральне споживання зменшується, що в поєднанні з катаболізмом може спричинити втрату ваги і, в довгостроковій перспективі, погані неврологічні результати, захворюваність та смерть 43. Доступ до MCA через ICA не вимагає жодного втручання в ECA та його відділення. Таким чином, під час нової процедури MCAO ніяких побічних ефектів не викликається, і щури, які проходять процедуру, не відчувають проблем з вагою, захворюваністю або смертю.

Тести, що використовуються для оцінки основних депресивних факторів, таких як депресивна поведінка, ангедонія, нерухомість та порушення навчання та пам'яті, є стандартними процедурами, що застосовуються на моделях депресії на тваринах до 51, 52. На тест на поведінку, такий як тест на примусове плавання Порсольта, часто впливають незвичні рухові навички після MCAO. Тут цей тест використовували через 30 - 33 дні після операції, щоб визначити, що індукція PSD у модифікованих щурів MCAO не впливала надмірно на їх рухові навички. Згідно з результатами, щури з досліджуваної групи показали загальну поведінку втечі, порівнянну з поведінкою лобкових контрольних щурів. Щури MCAO мали значно більше невдалих втеч, значно більшу тривалість нерухомості та меншу перевагу до сахарози порівняно з овечими тваринами. Це свідчить про те, що ця методика MCAO є здатною альтернативою оригінальному методу MCAO.

Різниця між включенням та виключенням щурів у процедуру MCAO для більш широкої експериментальної оцінки дуже залежить від результату операції. За допомогою моделі, пов'язаної з MCAO, спричиненою PSD, можуть бути утримані деякі небажані побічні ефекти MCAO, що залишає місце для включення менших і, можливо, більш крихких щурів у процедуру MCAO. Представлена ​​тут модель MCAO на тваринах пропонує сценарій зменшення ненавмисних результатів після індукованої MCAO PSD, оскільки вона має потенціал зменшити варіабельність у зміні ваги, набряку мозку та обсязі інфаркту та смертності від MCAO. Цей метод потенційно може служити інструментом для оцінки майбутньої терапії ПСД та надання доклінічних даних про ефективність терапевтичних речовин, а також для моніторингу інших факторів, що змінюють модальність клінічного результату при інсульті та ПСД.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.