Використання флуоресцентного резонансного перенесення енергії in vitro для вивчення динаміки білкових комплексів при

Резюме

Білково-білкова взаємодія є критично важливою для біологічних систем, а дослідження кінетики зв'язування дають змогу зрозуміти динаміку та функцію білкових комплексів. Ми описуємо метод, який кількісно визначає кінетичні параметри білкового комплексу, використовуючи флуоресцентний резонансний перенос енергії та техніку зупиненого потоку.

Анотація

Вступ

Біологічна активність в кінцевому підсумку здійснюється білками, більшість з яких взаємодіють з іншими для належних біологічних функцій. За використання обчислювального підходу, загальна кількість взаємодій білків і білків у людини, як прогнозується, складе 650 000

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Завантажте файл структури комплексу Cul1 • Cand1 з Банку даних білків (файл 1U6G).
2. Показати структуру комплексу в PyMOL Cul1 • Cand1.
3. Функція вимірювання в меню " Помічники "від PyMOL для оцінки відстані між першою амінокислотою Cand1 та останньою амінокислотою Cul1 (рис. 1).
4. Завантажте онлайн-переглядач спектрів (див Таблиця матеріалів) і відображати спектри збудження та випромінювання 7-аміно-4-метилкумарину (АМС) і одночасно спалахувати (Рисунок 2). Зверніть увагу, що AMC є донором ладу, а Blitz - акцептором ладу.

Рисунок 1: Кристалічна структура Cul1 • Cand1 та вимірювання відстані між потенційними мітками мічення. Файл кристалічної структури було завантажено з Банку даних білків (файл 1U6G) і переглянуто в PyMOL. Вимірювання між вибраними атомами проводили за допомогою PyMOL. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Рисунок 2: Спектри збудження та випромінювання флуоресцентних барвників для Бунда. Відображаються спектри AMC (7-аміно-4-метилкумарин) та FlAsH. Штрихові лінії показують спектри збудження, а суцільні - спектри випромінювання. Спочатку зображення було створено флуоресцентним SpectraViewer і було змінено для кращої чіткості. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

2. Приготування Cul1 AMC • Rbx1, білок-донор FRET

1. Побудуйте плазміди для експресії людської сортази Cul1 • Rbx1 у клітинах E. Coli. Зверніть увагу, що дві плазміди Co, що експресують людський Cul1 • Rbx1 у клітинах E. Coli, детально описані в попередньому звіті 20.
   1. Додайте послідовність ДНК, що кодує "LPETGGHHHHHH" (сортаза, сено 6 днів) до 3 'кінця кодуючої послідовності Cul1 стандартними методами ПЛР та клонування 21, 22 .
   2. Послідовність нової плазміди для підтвердження вставки гена є точною.
2. Сортаза Co Express Cul1 • Rbx1 у клітинах E. Coli. Метод походить із попереднього звіту 20.
   1. Змішайте 100 нг двох плазмід з хімічно компетентними клітинами BL21 (DE3) для ко-трансформації, використовуючи метод Heat Shock 23. Вирощуйте клітини на агаровій пластинці LB зі 100 мкг/мл ампіциліну та 34 мкг/мл левоміцетину при 37 ° С протягом ночі.
   2. Інокулюйте 50 мл культури LB свіжо трансформованими колоніями і вирощуйте протягом ночі при 37 ° С, струшуючи при 250 об/хв. Це дає початкову культуру.
   3. Інокулюйте 6 пляшок, кожна з 1 л середовища LB з 5 мл початкової культури, і вирощуйте при 37 ° C при 250 об/хв струшуючи до OD600

      3. Підготуйте Flash-Cand1, білок акцептора Бунда

      Примітка: Більшість кроків у цій частині збігаються з кроком 2. Умови, які відрізняються, докладно описані нижче.

      40 мкМ шляхом передачі буфера через мембранну ультрафільтрацію (відсічення 30 кДа). Оцініть концентрацію білка, використовуючи поглинання при 280 нм.Збережіть білок як аликвоти 50 мкл при -80 ° C.
      Примітка: Тут протокол можна призупинити.

3. Створення Flash Cand1.
   1. Додайте розчин для швидкого введення 1 мкл (див Таблиця матеріалів) до 50 мкл розчину TetraCys Cand1.
   2. Добре перемішайте та інкубуйте суміш при кімнатній температурі в темряві протягом 1-2 год до FlAsH Cand1.
      Примітка: Тут протокол можна призупинити.

4. Приготуйте Cand1, протеїн Бунда

ПРИМІТКА: Протокол приготування білка подібний до кроку 3 із наступними змінами.

1. Вставте послідовність кодування Cand1 вечірньої довжини у вектор pGEX-4 t-2.
2. Замініть буфер, використаний на кроці 3.3.5, на буфер, що містить 30 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ DVB-t, 10% гліцерину.
3. Виключити кроки 3.3.7 та 3.3.8.

5. Тестуйте та підтверджуйте аналіз Бунда

6. Виміряйте об’єднання константи швидкості (купіть) Cul1 • Cand1

ПРИМІТКА. Детальні відомості про роботу флуориметра із зупиненим потоком були описані в попередньому звіті 26.

7. Виміряйте константу швидкості дисоціації (koff) Cul1 • Cand1 у присутності Skp1 • F-box білка.

Примітка: Цей крок подібний до кроку 6 із наступними змінами.

1. У шприці A, в положенні наповнювати, Завантажте розчин 100 нМ Cul1 AMC • Rbx1 та 100 нМ FlAsH Cand1 у пучок буфера. Поверніть приклад положення "ДИСК".
2. Завантажте у шприц B під положенням наповнювати, розчин Skp1 • Skp2 (підготовлений відповідно до попереднього звіту 20). Поверніть приклад положення "ДИСК".
3. Відкрий Панель управління під набувати Програмуйте AMC для запису в програмне забезпечення та викиду Cul1 на 30 с. Потім зробіть один знімок. Флуоресцентні сигнали з часом збільшуються після змішування шприца з розчинами A та шприца B (рис.5).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Малюнок 3: Репрезентативний аналіз Бунда для утворення комплексу Cul1 • Cand1. Зразки в групі буферів (30 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ DVB-t, 1 мг/мл овальбуміну, рН 7,6) викликали захоплення при 350 нм, а викиди сканували від 400 нм до 650 нм. (A) Спектри випромінювання 70 нМ Cul1 AMC, 70 нМ FlAsH Cand1 (повний) та суміші обох (FRET). Cand1 (повний) означає повна довжина Cand1. (B) Спектри випромінювання 70 нМ Cul1 AMC, 70 нМ FlAsH Cand1 та суміші обох (FRET). У цьому експерименті та пізніше використовували Cand1 із видаленою першою спіраллю. (C) Спектри випромінювання Чейза від 70 нМ Cul1 AMC, 70 нМ FlAsH Cand1, суміші обох (FRET) та контролю Bund (Chase). Зразок Чейза містив 70 нМ Cul1 AMC, 700 нМ Cand1 і 70 нМ FlAsH Cand1. (D) Спектри випромінювання 70 нМ Cul1 AMC, суміш 70 нМ Cul1 AMC і 70 нМ FlAsH Cand1 (Bund) і 700 нМ Skp1 • Skp2 додано до 70 нМ Cul1 AMC • FlAsH Cand1 комплексу. На кожній ділянці сигнали випромінювання нормували до випромінювання 70 нМ Cul1 AMC при 450 нм. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Для вимірювання закупівлі Cul1 • Cand1 за допомогою встановленого тесту FRET шляхом зменшення сигналу кодера з часом на моніторі флуориметра із зупиненим потоком ми спочатку протестували та визначили концентрацію білка, який буде використовуватися. Коли використовували 5 нМ Cul1 AMC та FlAsH Cand1, спостерігалося дуже мало зміни сигналу (рис. 4А) тоді як при збільшенні концентрації кожного білка до 50 нМ спостерігалось зменшення сигналу з часом (рис. 4b), і ця зміна була скасована, коли буфери без FlAsH Cand1 (рисунок 4) додано. Тому 50 нМ Cul1 AMC використовували для подальшого аналізу, і ряд спостережуваних констант швидкості асоціації (kObs) вимірювали змішуванням 50 нМ Cul1 AMC із збільшенням концентрацій FlAsH Cand1. KObs для кожного експерименту розраховували шляхом включення посилань на експоненціальну криву, і kObs, отримані з тієї ж концентрації FlAsH Cand1, усереднювали. Побудуйте графік середнього kObs з концентрацією Cand1 та лінійною регресією (рис.4) виконати, покупка була визначена 7.27 .

Малюнок 4: Репрезентативне вимірювання постійної швидкості клубу. (A) флуоресценція 5 нМ Cul1 AMC контролювалась флуориметром із зупиненим потоком з часом після додавання 5 нМ FlAsH Cand1. (B) флуоресценцію 50 нМ Cul1 AMC контролювали за допомогою флуориметра із зупиненим потоком з часом після додавання 50 нМ FlAsH Cand1. (C) флуоресценцію 50 нМ Cul1 AMC контролювали флуориметром із зупиненим потоком з часом після додавання буфера Бунда. (D) купити для облігації Cand1 до Cul1. k-Obs Cul1 • Показано Cand1 при різних концентраціях Cand1. Лінійний нахил дає купівлю 1,8 х 10 7 М -1 с -1. Для відображення смужок помилок ± SEM; n = 4. Усі зразки були підготовлені в згустковому буфері і збуджені при 350 нм. Смуговий фільтр був використаний для збору сигналів від AMC і для виключення блискавичних сигналів. Жодні дані не були нормалізовані. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Подібно вимірюванню закупівлі, ми вимірювали константу швидкості, що спостерігається, дисоціацію Cul1 • Cand1, відстежуючи збільшення (відновлення) сигналу донора з часом на флуориметрі із зупиненим потоком. Cul1 AMC та FlAsH Cand1 спочатку змішували, а потім Skp1 • Skp2 додавали до попередньо зібраного Cul1 AMC • FlAsH Cand1 на флуориметрі із зупиненим потоком. Сигнал кодера швидко зростає, і він виявляє kObs 0,4 с -1 (рис.5). На відміну від цього, коли буфер був доданий до попередньо зібраного Cul1 AMC • FlAsH Cand1, посилення сигналу не спостерігалося, що свідчить про швидку дисоціацію Cul1 • Cand1 викликано Skp1 • Skp2.

Рисунок 5: Репрезентативне вимірювання константи швидкості дисоціації. Зміну флуоресценції донора порівняно з часом вимірювали після додавання 150 нМ Skp1 • Skp2 або буфера Бунда до 50 нМ Cul1 AMC • комплексу FlAsH Cand1. Зміни сигналу були пристосовані до експоненціальної кривої, і спостерігається константа швидкості дисоціації 0,4 с -1. Умови експерименту були подібні до тих, що зображені на малюнку 4описано. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Оскільки лад чутливий і кількісний, він став важливим інструментом для вивчення взаємодії між макромолекулами. Цей протокол наводить приклад використання ладу для вивчення динаміки білкових комплексів у розчині. Бунд також використовувався разом з візуалізацією живих клітин для вивчення молекулярних взаємодій у живих клітинах 36, що є потужним фактором виявлення динаміки білкових комплексів у фізіологічних умовах. Крім того, лад може також використовуватися на рівні однієї молекули, вивчаючи динаміку макромолекулярних комплексів 37, 38 у реальному часі, вивчаючи уявлення про конформаційні зміни комплексу. Для підвищення ефективності та виявлення ладу великий інтерес представляють флуорофори та біосенсори з яскравістю та фотостійкістю, які активно розробляються та вивчаються 28, 39 .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

---