Вимірювання тривалості життя в протоколі Drosophila melanogaster (переклад на німецьку)
Резюме
Drosophila melanogaster - це потужна модель для вивчення молекулярних основ регулювання довголіття. У цьому протоколі обговорюються кроки, пов’язані із створенням відтворюваного вимірювання тривалості життя на основі популяції, а також потенційні підводні камені та способи їх уникнення.
Анотація
Старіння - явище, яке призводить до стаціонарного фізіологічного погіршення стану майже у всіх організмах, в яких воно вивчалось, що призводить до зниження фізичної працездатності та збільшення ризику захворювання. Індивідуальне старіння проявляється на рівні населення як збільшення вікової смертності, яке часто вимірюється в лабораторії шляхом спостереження за тривалістю життя у великих когортах людей того ж віку. Експерименти для спроби кількісно визначити, наскільки генетичні або екологічні маніпуляції впливають на тривалість життя у простих модельних організмів, були надзвичайно успішними для розуміння аспектів старіння, що мають відношення до таксонів, і для натхнення нових стратегій продовження тривалості життя та попередження вікових захворювань ссавців зберігаються .
Протокол
Ми рекомендуємо зберігати експериментальний корм, дріжджову пасту та пластинки з виноградного агару, які з’являються в протоколі при 4 ° C, і використовувати їх протягом 1-2 місяців, якщо не встановлені форма та сухість. Стандартні умови навколишнього середовища як для личинок, так і для дорослих включають підтримку стадії Літає в інкубаторі при 25 ° C з 12:12 год циклом світло-темно та відносною вологістю 60%.
А. Підготовка до експериментальної кулінарії
- Для росту личинок ми використовуємо модифікований Caltech Medium 5, який у цьому протоколі скорочено називається CT.
- Ми рекомендуємо дієту для дорослих дрозофіл (SY), яка складається з цукру (сахарози) та дріжджів (ліофілізованих цільних пивних дріжджів) на 2% -ній агаровій основі, яка була прокип’ячена, доповнена антибіотиками та протигрибковими засобами та розподілена (10 мл на флакон) 6. Перед зберіганням їжі слід застигнути та випаруватися протягом 12-24 годин. Оскільки поживне середовище може суттєво впливати на тривалість життя, послідовність методів приготування їжі є важливою як в рамках експерименту, так і для порівняння між експериментами.
- Якщо до їжі для дорослих слід додати фармакологічний засіб, цей препарат можна змішати у невеликій порції їжі та нанести (2 мл) на поверхню їжі з контрольними флаконами, що містять шари носія.
2. Приготуйте живу дріжджову пасту
5-6 мл води з’єднати з 3 г сухих дріжджів і добре перемішати. Консистенція дріжджової пасти повинна відповідати консистенції гладкого арахісового масла.
3. Підготувати пластинку з виноградного агару
- Додайте упаковку преміксу виноградного агару в 500 мл дистильованої води в пляшку на 1000 мл і дотримуйтесь інструкцій на упаковці, щоб розчинити суміш виноградного агару.
- Обережно налийте товстий шар суміші в 100-міліметрові чашки Петрі, уникаючи пузирців. Упаковка Premix виробляє близько 14 пластинок виноградного агару.
- Дайте носіям охолонути і затвердіти при кімнатній температурі із закритою кришкою протягом 15 хв. Пластини можна зберігати при 4 ° C, загортати у поліетиленову плівку або негайно використовувати.
4. Синхронізований збір яєць
Усі середовища, що використовуються в цьому протоколі, тобто дріжджі, пластинки виноградного агару, КТ та продукти харчування 10% SY, повинні бути кімнатної температури.
5. Колекція дорослих мух, що відповідають віку
- Дорослі, як правило, вилуплюються з 9 дня з першого дня. Викиньте мух, що з’явилися в перший день, і поставте пляшки назад в інкубатор на ніч. Ця практика дозволить уникнути випадкових виборів для початку аварійних ситуацій та для збору максимальної кількості синхронізованих мух.
- Через 16-22 години добова доросла людина летить у пляшки з їжею на 10% SY. При необхідності наступного дня можна зібрати ще одну партію.
- Мухи повертаються назад в інкубатор і дозволяють мухам досягти статевої зрілості та спаровуватися протягом двох днів. Запишіть день передачі на 10% SY пляшках як перший день дорослості.
6. Сортування мух та проведення експерименту з довголіттям
- Знеболіть невеликі групи мух на анестезуючій подушці, потім сортуйте чоловіків та жінок на дві групи пензлем. При використанні СО 2 важливо мінімізувати вплив можливих довгострокових проблем зі здоров'ям, які можуть порушити цілісність експерименту з довголіттям.
- Помістіть 30 мух тієї ж статі в окремі флакони. Якщо не взяти хромосом-балансирів у популяції та здорових нащадків, кожна пляшка повинна виробляти приблизно 3-4 флакони кожної статі. Аліквація мух в окремі флакони не повинна перевищувати 3-4 хв, так що протягом усього часу мухи піддаються наркозу лише максимум 9-10 хв.
- Повторюйте кроки до 6.1-6.2, є 8-10 повторень флаконів для кожної статі та експериментальної терапії.
7. Налаштуйте таблицю Excel для відстеження експерименту з довголіттям
- Ми рекомендуємо рандомізувати положення флакона, а не групувати флакони за експериментальними умовами, щоб уникнути перекосів у положенні флакона в інкубаторі та щоб затемнити ідентичність флакона для експериментатора. Для цього спочатку призначте рандомізований цифровий ідентифікатор кожному флакону в електронній таблиці, а потім розташуйте флакони в лотках за ідентифікаційним номером. Якщо ви використовуєте програмне забезпечення для керування експериментами dLife, дотримуйтесь інструкцій з налаштування експерименту, щоб створити ідентифікаційний номер для кожного флакона.
- (Необов’язково) Якщо ви використовуєте зчитувач RFID або пристрій зчитування штрих-коду у співпраці з dLife, приєднайте до кожного флакона тег RFID або штрих-коду та зв’яжіть тег з ампулою з цифровим ідентифікатором у dLife. Програма розпізнає кожен флакон при скануванні за допомогою зчитувача та ініціює запис даних у правильному місці в таблиці. Використання пристрою зчитування тегів спільно з dLife зменшує час збору даних та помилки у записі.
8. Підтримка експерименту з довголіттям
Флакони зі свіжими продуктами повинні бути кімнатної температури при кожному перенесенні.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Спрощена схема протоколу в ілюстрація 1, де окреслюються важливі кроки. Частина синхронізації протоколу може вимагати зрізних мух дорослих для різних аналізів.
Типові криві виживання мух дикого типу показані в Малюнок 2а показано за допомогою програмного забезпечення для керування експериментами dLife (Рис. 2b, c). Дорослі чоловіки в основному живуть коротше життя, обидві популяції досягають середньої та середньої тривалості життя> 50 днів при 10% SY їжі при 25 ° C. Зверніть увагу, що вижилий залишається високим на початку експерименту, а потім падає експоненціально.
На тривалість життя дрозофіли впливають умови навколишнього середовища, такі як температура та дієта. Малюнок 3а показує, що дорослі чоловіки, як правило, живуть значно менше при підвищенні температури. Точно так само дієвий ефект діє на все життя у 3б подарунки: Дорослі самки мух на менш концентрованому харчуванні (5% SY) зазвичай живуть значно довше, ніж ті, хто сидить на більш концентрованому харчуванні (15% SY).
Щільність когорт під час розвитку може впливати на тривалість життя дорослих та змінювати терміни розвитку. Тут ми покажемо приклад того, як різні щільності синхронізованих яєць впливають на розвиток личинок. Як у 4 показано, врожайність дорослих мух погана, а поверхня їжі схильна до висихання, коли кількість яєць занадто низька. На іншому кінці спектру розвиток личинок затримується у переповнених пляшках, а врожай дорослих мух знижується.
На криву виживання когорти в цілому можуть суттєво впливати ненормальні ефекти флаконів, як у Малюнок 5 показано. Нерегулярні дані про виживання окремих флаконів можуть мати кілька причин, таких як погана якість їжі або накопичення бактерій/грибків та інфікування. Хоча такі ненормальні смерті не можуть перекосити показник виживання населення, не існує простої метрики для адекватного визначення того, що флакон слід виключити з експерименту. Отже, цих ситуацій найкраще уникати належного поводження та пом’якшувати за допомогою великого обсягу вибірки.
Малюнок 2. (А) Репрезентативні криві тривалості життя w 1118, що контролюють самок (круги) та самців (квадрати) дорослих мух при 25 ° C на їжі SY10%. (B, C) Типові знімки екрана програмного забезпечення dLife.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Представлений тут протокол описує метод для відтворюваних вимірювань довголіття дорослих у дрозофіли, який є адаптивним для оцінки генетичних, фармакологічних та екологічних втручань. Основні аспекти протоколу включають ретельний контроль середовища розвитку личинок, мінімізацію стресу дорослих та мінімізацію упередженості щодо експериментальних груп та контролів. Ми також представляємо використання програмного забезпечення для управління експериментами dLife. Просто прикріпивши штрих-код або тег RFID до кожного судна, програма допоможе в отриманні даних dLife для кожного вимірювання та побудові кривої виживання. Хоча в даний час він найкраще підходить для вивчення тривалості життя мух за допомогою флаконів, цей інструмент управління експериментами може бути легко пристосований для використання в інших організмах, з різними типами популяційних камер, або для додаткових заходів, включаючи стійкість до стресу та виживання Токсичність лікарських засобів.
Важливі аспекти контролю середовища личинок/лялечок включають уникнення перенаселеності та підтримання контрольованого середовища із суворим регулюванням світло-темних періодів, вологості та температури. Ці фактори впливають як на терміни розвитку, так і на фізичну якість дорослих. Небажані середовища личинок, такі як висока щільність личинок, можуть призвести до активації факторів, викликаних стресом (наприклад, експресія білка теплового шоку), які, як відомо, впливають на довголіття дорослих 18.
Запропоновано альтернативні підходи до годування для аналізу тривалості життя, включаючи підхід до капілярної подачі (метод CAFE) 23. Цей метод характеризується здатністю забезпечувати точні вимірювання споживання їжі, однак він призводить до значно більшої кількості короткочасних мух 24. Можливі стреси, пов’язані із середовищем годування, слід використовувати для оцінки поєднаного зв’язку між дієтою та генетичними факторами в загальному довголітті буде.
Демографічний аналіз, включаючи обчислення кривих виживання та смертності, може виявити багато інформації про динаміку старіння населення. Типова крива виживання залишатиметься відносно рівною протягом тривалого періоду на початку життя та збільшуватиме темпи зниження у жінок старшого віку, що відповідає періоду низької смертності, за яким слідує період експоненціального зростання смертності. Стресове середовище зазвичай проявляється як надлишок передчасної смерті серед населення та ненормальне падіння кривої виживання. Хоча такий результат може дати значні відмінності між лікуваннями, він, як правило, не є надійним для реплікації. Тому ми рекомендуємо провести щонайменше два незалежних (тобто, не перехідних) повторюваних експерименти, перш ніж можна зробити твердий висновок. Можуть знадобитися додаткові зусилля для збільшення обсягу вибірки, контролю умов утримання та поліпшення здоров'я батьківських рослин.
Права цензура (вилучення тварин з експерименту, яких підозрюють у втечі або загибелі з випадкових причин) тварин, які гинуть від стресових умов навколишнього середовища, слід застосовувати з особливою обережністю. Власне кажучи, цензурний апарат повинен відбуватися випадковим чином під час експериментальних процедур, і якщо експериментальний засіб модулює чутливість до стресу, можна ненавмисно застосувати вибір рівня лікування до населення. Як загальне правило, уникати наявності неоднозначних факторів, які можуть спричинити ранню смерть (особливо пов'язаних з джерелом їжі), краще, ніж пристрій цензури, і пристрій цензури слід застосовувати лише до організмів, за якими спостерігається загибель або втеча під час фізичних маніпуляцій.
Остаточним розглядом є оцінка статистичної значимості. Хоча великі розміри когортних зразків забезпечують значну ефективність у розрізненні невеликих відмінностей між обробками, також слід враховувати потенційне біологічне значення такої різниці. При досить великих експериментах з довголіттям різниця часто досягає 2,1% статистично високо значущих, але загальний вплив втручання на стан здоров'я може бути невеликим. Отже, при інтерпретації загальних результатів експерименту необхідно надати як статистичне, так і біологічне значення. Висновки про процес старіння в експериментах з виживання можуть бути доповнені мірами вікового зниження поведінкових або фізіологічних заходів щодо охорони здоров'я, включаючи здатність до скелелазіння 25 та цілісність шлунково-кишкової стінки 7.
На закінчення, модель організму дрозофіли є привабливим вибором для вивчення механізмів старіння. За допомогою ретельної експериментальної техніки надійний демографічний аналіз може дати розуміння впливу фармакологічних та генетичних факторів на процес старіння.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.