Вплив акарицидів на медоносних бджіл Apis mellifera intermissa та аналіз активності

ДЕМОКРАТИЧНА І НАРОДНА РЕСПУБЛІКА АЛЖИР Міністерство вищої освіти і наукових досліджень BADJI- Мохтар-Аннаба УНІВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ НАУК ВІДДІЛУ Лабораторія Лабораторія біології тварин ПРИКЛАДНОЇ екологічної біологія Теза PHOXICIDE ПО PHARSIOLOGY 3-й CYOTOSIS OF PHARSIOLOGY В PHARSIOLOGY ПРИКЛАДНИХ екологічна біології 3-й CYOTOSY ФАРСІОЛОГІЇ У ФАРСІОЛОГІЇ 3 РОБОТА ФАРСІОЛОГІЇ У ФАРСІОЛОГІЇ 3 УНІВЕРСИТЕТ МОХТАР-АННАБА 3 медоносний бджола Apis mellifera intermissa та аналіз антимікробної активності прополісу та меду. Представлено: Мадам Нейла НЕДЖІ Перед журі у складі: Президент: М. Нуреддін СОЛТАНІ Директор дипломної роботи: Мадам Вахіда АЯД-ЛУЧИФ Експерт: Мадам Фузія ТІНЕ-ДЖЕБАР Експерт: М. Камель ЛУАДІ Експерт: М. Мохамед АХОУ Експерт: Мадам Селіма БЕРЧІ пр., Ун-т Annaba MCA, ун-т. Annaba MCA, ун-т. Тебесса, ун-т. Костянтин Пр., Ун-т Annaba Pr., E.N.S.B. Костянтин УНІВЕРСИТЕТ РІК 2014/2015

Ми хотіли б подякувати професору Д. КІРАНЕ, який дозволив мені проводити всі мікробіологічні аналізи на рівні лабораторії мікробіології Університету Аннаби. Ми також дякуємо доктору І. БІТАМУ з Інституту Пастера в Алжирі за його неоціненну допомогу, надавши нам еталонні мікробні штами. Велика подяка панові Ф. БУСУСАКУ, пасічнику, а також його співробітникам за їх дорогоцінну та щедру допомогу пасіці. Я також хочу висловити щиру подяку всім людям, які прямо чи опосередковано зробили внесок у здійснення моєї роботи. Я висловлюю щиру подяку викладачам кафедри біології за допомогу та керівництво під час нашого навчання. Всім, хто безпосередньо чи опосередковано брав участь у здійсненні цієї роботи.

Присвяти Я присвячую цю роботу своїм батькам; що вони знаходять тут всю мою вдячність за підтримку протягом мого навчання. Моєму дорогому чоловікові Камелю, який так сильно мене підтримував. Моїм дорогим свекрухам. Моїм дітям Нурген, Фатен і Юнес. Моїм сестрам і братам. Моїм племінникам та племінницям. Моїм друзям. Кожному, хто прямо чи опосередковано сприяв розробці цієї тези.

4.2. Загальний вміст флавоноїдів прополісу. 33 5. Аналіз антимікробної активності прополісу. 34 5.1. Діаметри зон інгібування росту мікробних штамів. 34 5.2. Мінімальна інгібуюча концентрація прополісу. 6. Вплив щавлевої кислоти при місцевому застосуванні на специфічну активність глутатіону S-трансферази у робітників A.mellifera intermissa. 38 7. Вплив щавлевої кислоти на гістопатологію середньої кишки працівників A. mellifera intermissa. 39 II. ОБГОВОРЕННЯ.40 РОЗДІЛ II: Антимікробна активність меду та прополісу проти патогенних бактерій, що передаються їжею. I. РЕЗУЛЬТАТИ 1. Порівняння фізико-хімічних показників меду з різних фітогеографічних регіонів. 46 2. Порівняння вмісту поліфенолів та загальних флавоноїдів у меді та прополісі у різних фітогеографічних регіонах. 47 3. Аналіз антимікробної активності меду та прополісу з різних фітогеографічних регіонів щодо патогенних бактерій, що передаються їжею. 48 II. ОБГОВОРЕННЯ. 49 ВИСНОВКИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ. 54 РЕЗЮМЕ. 56 французька. 56 англійська. 58 арабська. 60 БІБЛІОГРАФІЧНА ЛІТЕРАТУРА. 62 ДОДАТКИ (НАУКОВЕ ВИРОБНИЦТВО). 100

СПИСОК ТАБЛИЦ Таблиця 1. Порівняння середніх значень фізико-хімічних показників меду до обробки акарицидами ... 26 Таблиця 2. Порівняння середніх значень фізико-хімічних показників меду після обробки акарицидами ... 27 Таблиця 3. Мінімальні концентрації інгібітора меду (мг/мл) до та після обробки акарицидами для кожного штаму мікробів. 32 Таблиця 4. Мінімальна інгібуюча концентрація етанольного екстракту прополісу (мкг/мл) до та після обробки акарицидами для кожного мікробного штаму. 37 Таблиця 5. Порівняння середніх значень фізико-хімічних показників меду за регіонами. 46 Таблиця 6. Порівняння середніх значень вмісту поліфенолів та загальних флавоноїдів у меді та прополісі за регіонами. 47

Рисунок 17. Питома активність глутатіон-S-трансфераз (мкм/хв/мг білка) середньої кишки новоспечених робітників після місцевого застосування щавлевої кислоти. 38 Рисунок 18. Мікроскопічні зображення епітелію кишечника бджоли, обробленої щавлевою кислотою ( 3,5%). 39 Рисунок 19. Мікроскопічні зображення епітелію кишечника бджоли, обробленої щавлевою кислотою (20%). 39 Рисунок 20. Діаметри зон інгібування (мм) росту бактерій медом на рівні кожної фітогеографічної області. 48 Рисунок 21. Діаметри зон інгібування (мм) росту бактерій етанольним екстрактом прополісу на рівні кожної фітогеографічної області. 49

Введення серед паразитів бджіл, Varroa destructor (Acari: Varroidae) (Anderson & Trueman, 2000) вважається однією з найсерйозніших загроз для Apis mellifera (de la Rúa et al., 2009; vanengelsdorp & Meixner, 2010; Brodschneider et, 2010; Chauzat et al., 2010; Dahle, 2010; Genersch et al., 2010; Guzmán-Novoa et al., 2010; Potts et al., 2010; Rosenkranz et al., 2010; Schäfer et al. ., 2010; Topolska et al., 2010; Vanengelsdorp et al., 2010; Noireterre, 2011; Martin et al., 2012). V. destructor - це екстрапаразитний бджолиний кліщ, який харчується своєю гемолімфою (Dahle, 2010; Martin et al., 2010; 2012; Nazzi et al., 2012). Він може мати три типи дії на Apis mellifera: механічну (Kanbar & Engels, 2003), вектор багатьох збудників інфекції бджіл (Weinberg & Madel, 1985; Tentcheva et al., 2004; Shen et al., 2005; Prisco et al. al., 2011; Wendling, 2012; Dainat et al., 2012) та спойлер (Duay et al., 2003). Наслідки вароатозу для бджіл полягають, головним чином, у зменшенні в організмі організму концентрації білків та гемолімфатичних вуглеводів при появі (Smirnov 1978; De Jong et al., 1982, Weinberg & Madel, 1985; Achou & Soltani, 1997; Bowen -Waker & Gunn, 2001) та довголіття (De Jong & De Jong, 1983; Schneider & Drescher 1987; Kovak & Craisheim, 1988, Amdan et al., 2004). Ми також спостерігаємо ранню активність пошуку робітників (Schneider & Drescher 1987) та труднощі з виживанням взимку (Kovac & Crailsheim, 1988). Інші фізіологічні особливості полягають у переродженні жирових тіл та недорозвиненні підгортанних залоз (De jong et al., 1982; De Jong & De Jong, 1983; Schneider & Drescher, 1987). Також спостерігаються зміни в онтогенезі та експресії глікопротеїдів сперми із зменшенням діаметра слизової залози та насінної бульбашки, а також кількості сперми (Rinderer et al., 1999). Зменшення розміру антенального джгутика та кількості антенних сенсил (Abd EL-Wahab et al., 2006), а також зменшення виживання до появи (Rinderer et al., 1999); було зареєстровано кількість джмелів, які досягли віку статевої зрілості (Collins & Pettis, 2001) та частоти польотів (Schneider, 1987). Усі ці ефекти негативно впливають на конкурентний процес спарювання (Bubalo et al., 2005). 4

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ поширювання тварин та бджіл не мають патологічних симптомів і не обробляються пестицидами. Google Earth Рисунок 2. Географічне положення місця відбору проб меду та прополісу. Перед експериментами всі бджолосім'ї перевіряли для оцінки щільності популяції, наявності розплоду та присутності їжі в кожному вулику, щоб вибрати партію з 20 однорідних вуликів. Три групи цієї партії, кожна з яких містить по п’ять вуликів, обробляли акарицидами. Першу групу лікували флувалінатом. Інші дві групи обробляли 3,5% щавлевою кислотою (Charrière et al., 2004; Schneider et al., 2011) та 6% (Charrière, 2001). Контрольна група з п'яти інших вуликів не отримувала жодного лікування. Усі експерименти проводились у період з листопада по грудень 2011 р. 2. Презентація акарицидів та обробок Використовувані акарицидні засоби (флувалінат та щавлева кислота) є схваленими ветеринарними препаратами, що використовуються у боротьбі з ектопаразитним кліщем бджіл V. деструктор. 11

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ 2.1. Презентація флувалінату Флувалінат, з хімічною формулою C 26 H 22 ClF 3 N 2 O 3 (рис. 3) і торговою назвою якого є Апістан (Laboratoire Vita Europe), є частиною сімейства піретроїдів. Акарицид має форму смужок із розрахунку 0,80 г флувалінату на смужку. Дві смужки поміщають у вулик між рамами і залишають на місці на шість тижнів (Fernandez & Coineau, 2002; Gregorc & Smodis skerl, 2007; Lodesani et al., 2008). Рисунок 3. Хімічна структура флувалінату (www. Chemspider.com) 2.2. Презентація щавлевої кислоти Щавлева кислота - це органічна кислота з хімічною формулою H 2 C 2 O 4 (рис. 4). Його застосовували крапельним способом, який полягає у капанні шприцом 50 мл розчину щавлевої кислоти (3,5 г або 6 г щавлевої кислоти + 100 мл води + 50 г цукру) на полиці. І на бджоли розплоду гніздо: 5 мл на рівні дев'яти проміжків, розташованих між десятьма рамами, і 2,5 мл на рівні двох проміжків, утворених між 1-ю рамою і кінцем вулика та 10-ю рамою та другим кінцем вулика (Gregorc & Poklukar, 2003; Gregorc & Smodis Skel, 2006). Рисунок 4. Хімічна структура щавлевої кислоти (www. Chemspider.com) 12

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ галліка) проводять за однакових умов (рис. 5). Визначення загальних поліфенолів проводиться шляхом порівняння оптичної щільності, що спостерігається, з такою, отриманою за стандартом галової кислоти з відомою концентрацією 100-500 мкл (Gulcin et al., 2005). Рисунок 5. Стандартна крива для аналізу поліфенолів (галлова кислота як стандарт). Визначення загальних флавоноїдів проводили за методом Woisky and Salatino (1998). Використовуваний реагент являє собою безбарвний розчин трихлориду алюмінію (AlCl 3, 20%). Принцип методу заснований на окисленні цим реагентом флавоноїдів, в результаті чого утворюється коричневий комплекс, який поглинається при 420 нм. Порівняння оптичної щільності, що спостерігається, з такою, отриманою за допомогою стандарту кверцетину відомої концентрації, дозволяє оцінити вміст загальних флавоноїдів (рис. 6). Рисунок 6. Стандартна крива для визначення флавоноїдів (кверцетин як стандарт). 16

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Гістологічні препарати спостерігали під мікроскопом (Leica ICC, 50 HD) та фотографували за допомогою вбудованої цифрової камери. 11. Розташування місць відбору проб меду та прополісу для вивчення антимікробної активності щодо патогенних бактерій, що передаються харчовими продуктами. N, 7 37'E), Четаїбі (36 59'N, 7 19 'E), Беррахал (36 50 N, 7 26 E) та Ель-Буні (36 49 N, 7 39 E). Сераїді та Четаїбі розташовані далеко від дорожнього руху та мають дуже різноманітне медове квіткове багатство порівняно з Беррахалом та Ель-Буні (рис. 8). Усі зразки були зібрані у вересні 2013 р. Рисунок 8. Розташування регіонів відбору проб меду та прополісу. Google Планета Земля 24

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Антимікробну активність меду та прополісу перевіряли на чотирьох штамах бактерій, які зазвичай передаються з їжею: Bacillus cereus (IPA), золотистий стафілокок (ATCC25923R), кишкова паличка (ATCC25922) та синьогнійна паличка (ATCC27893R). 12. Статистичний аналіз Дані, що стосуються діаметрів зон гальмування, вмісту фенольних сполук, фізико-хімічних параметрів, питомої активності GST, виражаються як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (m ± sem) . Застосовували односторонній дисперсійний аналіз та критерій Тукі на порозі р = 0,05. Для всіх наборів даних рівність дисперсії перевірялася тестами Бартлетта та Брауна-Форсайта перед застосуванням дисперсійного аналізу. Розрахунки проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (програмне забезпечення GraphPad, La Jolla California, США, www. Graphpad.com). 25

РОЗДІЛ I Вплив двох акарицидів (флувалінату та щавлевої кислоти) на Apis mellifera intermissa РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

РОЗДІЛ I РОЗДІЛ I: Вплив двох акарицидів (флувалінату та щавлевої кислоти) на Apis mellifera intermissa. I. РЕЗУЛЬТАТИ 1. Порівняння фізико-хімічних показників меду до та після обробки акарицидами Фізико-хімічні характеристики меду, рН; вимірювали вміст води (%), електропровідність (мс/см) та зольність (%) у кожній пробі меду. Результати дисперсійного аналізу показують, що не існує суттєвої різниці для кожного виміряного параметра (р> 0,05) як до лікування (табл. 1), так і після обробки акарицидами (табл. 2). Таблиця 1. Порівняння середніх значень фізико-хімічних показників меду перед обробкою акарицидами (m ± SEM; n = 15). Гігрометрія Електропровідність Вміст (%) ph електричний (мс / см) золи (%) Контроль 17,55 ± 0,55 a 3,50 ± 0,11 a 0,42 ± 0,05 a 0,16 ± 0, 03 a Флувалінат 17,15 ± 1,15 a 3,70 ± 0,03 a 0,34 ± 0,10 a 0,11 ± 0,06 a Щавлева кислота (3,5%) 17,25 ± 0,25 a 3,68 ± 0,06 a 0,63 ± 0,11 a 0,28 ± 0,09 a Щавлева кислота (6%) 17,23 ± 0,26 a 3,65 ± 0,03 a 0,47 ± 0,01 a 0,19 ± 0,01 a по одній і тій же букві суттєво не відрізняються на рівні p> 0,05. 26

ГЛАВА I Зона інгібування T M2 M1 T-T + M3 Bacillus cereus Bacillus subtilus Staphylococcus aureus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Рисунок 11. Презентація результатів антимікробної активності меду щодо семи мікробних штамів. [Т +: позитивний контроль (ампіцилін, ністатин); T-: негативний контроль (вода); M 1, M 2, M 3: зразки меду; T: Miel Témoin] (Фотографії зроблені Н. НЕДЖІ в лабораторії мікробіології Університету Аннаби). 30

Зона інгібування (мм) Зона інгібування (мм) РОЗДІЛ I 16 14 12 10 8 6 4 2 0 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Контроль Флувалінат Оксалова кислота (3,5%) Оксалева кислота (6%) Перед лікуванням A 14 12 10 8 6 4 2 0 abbbabbbabbbabbbabbba bbbaaaa Контроль Флувалінат Оксалова кислота (3,5%) Оксалева кислота (6%) Після обробки B Рисунок 12. Діаметри зон інгібування (мм) меду до обробки (A) та після обробки (B) акарицидами для кожного штаму мікробів (m ± SEM; n = 15). (Для кожного штаму різні літери вказують на суттєві відмінності між обробками р 0,05). Результати показують, що перед лікуванням та для кожного випробуваного штаму не спостерігалось значної різниці в діаметрах зон інгібування ні для штамів бактерій, ні для штаму Candida albicans. Після обробки акарицидами результати показують, що діаметр зон гальмування для кожного виду бактерій значно менший у медах, зібраних із колоній, оброблених флувалінатом та щавлевою кислотою, порівняно з медами з контрольних колоній. Candida albicans здається нечутливою до дії меду. Свідки 31

РОЗДІЛ I Зона гальмування T P1 T- T + P2 Y P3 Bacillus cereus Bacillus subtilus Staphylococcus aureus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Рисунок 15. Презентація результатів антимікробної активності етанольних екстрактів прополісу з екстрактів прополісу мікробні штами. [Т +: позитивний контроль (ампіцилін, ністатин); T-: негативний контроль (етанол); P 1, P 2, P 3: зразки прополісу; Т: Свідок прополісу] (Фотографії зроблені Н. НЕДЖІ в мікробіологічній лабораторії Університету Аннаби) 35

Зона інгібування (мм) Зона інгібування (мм) РОЗДІЛ I 14 12 10 8 6 4 2 0 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Контроль Флувалінат Оксалова кислота (3,5%) Оксалева кислота (6%) Перед лікуванням A 14 12 10 8 6 4 2 0 abbbbbb ab ab ab ab ab ab abbbabbbaaaa Контроль Флувалінат Щавлева кислота (3,5%) Щавлева кислота (6%) Після обробки B Рисунок 16. Діаметри зон інгібування (мм) етанольних екстрактів прополісу до обробки (A) та після обробки (B) з акарицидами для кожного штаму мікробів (m ± SEM; n = 15). (Для кожного штаму різні літери вказують на суттєві відмінності між обробками р 0,05). Результати показують лікувальний ефект на діаметри зон інгібування антимікробної активності етанольних екстрактів прополісу для кожного штаму бактерій. Діаметри зон гальмування значно менші в 36