З клініки медичного університету

1 З клінічного відділення медичного університету ΙΙΙ Фрайбурзького університету імені Альберта Людвіга i. Br. Роль TRAF2 та TRAF6 в атеросклерозі I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N для здобуття ступеня доктора медичного факультету Університету Альберта-Людвігса у Фрайбурзі. Б. Представлений у 2010 році народженим у Пітері Стахоні Геппінгені

університету

2 декан: проф. Лікар. hc.c. мульти. Губерт Еріх Блюм 1-й рецензент: PD Dr. Андреас Зірлік 2-й рецензент: PD Dr. Майкл Гофманн Рік доктора філософії: 2011

4 Зміст TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі Генотипування мишей: виділення ДНК Генотипування мишей: ланцюгова реакція полімерази (ПЛР) Трансплантація клітин печінки плода у мишей Процес трансплантації клітин печінки плоду Генерування донорських стовбурових клітин Генотипування донорів: Qiagen-Kit Мієлоаблативне опромінення реципієнта та трансплантація Трансплантація стовбурових клітин печінки мишам CD45.1 Дослідження годівлі Ретроорбітальний збір крові перед дієтою Висока доза холестеринової дієти Оцінка атеросклерозу Підготовка мишей після 18-тижневої дієти з високими дозами холестерину Виробництво препаратів для черевної аорти Виробництво гістологічних препаратів Колір Олія-Червоний- Фарбування для фарбування вмісту жиру в артеріальній стінці Імуногістохімічне фарбування MAC-3 для макрофагів в артеріальній стінці Імуногістохімічне фарбування CD4 + T хелперних клітин Імуногістохімічне фарбування гладком'язових клітин K Колаген: Пікросіріус Червоне фарбування Оцінка Фотографування розділів Оцінка кореня аорти Оцінка дуг аорти та черевної аорти. 42

8 Вступ TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі Рис. 1: У Європі серцево-судинні захворювання є найпоширенішою причиною смерті Найчастішою причиною смерті є захворювання чоловіків (вгорі) та жінок (внизу). Більшість із цих захворювань патофізіологічно засновані на атеросклерозі. Джерело:

52 Результати TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі Після чотиритижневої фази відновлення у мишей брали кров, і це оцінювали за допомогою FACS для відновлення CD45.1 шляхом подвійного фарбування CD45.1-APC та CD45.2-PE. Цей експеримент показує успішне відновлення: 95,2% та 95,0% клітин крові замінено стовбуровими клітинами, отриманими з печінки плода. Крім того, було показано, що CD19-позитивні В-лімфоцити, CD3-позитивні Т-лімфоцити та CD11b-позитивні лейкоцити, такі як моноцити, макрофаги, гранулоцити та природні клітини-кілери, несуть маркер CD45.1 після трансплантації клітин печінки плода. Якщо більш детально проаналізувати ці підгрупи, можна побачити, що CD11b- та CD19-позитивні клітини замінені донорськими клітинами до більш ніж 99%. Тільки в групі Т-клітин є близько 4% клітин-реципієнтів, які, швидше за все, є Т-клітинами пам'яті (рис.7).

53 Результати TRAF2 і TRAF6 при атеросклерозі Рис. 7: Успішне відновлення клітин периферичної крові шляхом трансплантації клітин печінки плода LDLR -/- мишей (CD45.2 позитивні/cd45.1 негативні, A) опромінювали мієлоаблативно (2x450cGy) і клітинами печінки плода з днів старі плоди (CD45.2 негативні, CD45.1 позитивні, B) відновлені. Через 4 тижні мишам зробили кров і провели FACS-аналіз пересаджених тварин на поверхневі маркери CD45.1 та CD45.2 (наприклад, C.

59 результатів TRAF2 +/+/LDLR -/-: мм2, 0,53 ± 0,18 +/+ контрольна група (TRAF2/LDLR Також TRAF2- стовбурові клітини гетерозиготних відновлених TRAF2 і TRAF6 при атеросклерозі -/- N = 13, p = +/+ 0,56) порівняно з -/- до 2 у TRAF2/LDLR: 0,41 ± 0,08 мм, N = 16). Одержувачі, які мали дефіцит TRAF2 з однаковим розміром атеросклеротичних уражень (TRAF2 -/-/LDLR -/- у TRAF2 +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 мм2, N = 17, p = 0,60, рис. 12). Окрім розміру атеросклеротичного ураження, його склад також представляє великий інтерес, оскільки він впливає на стабільність нальоту. Якщо частка ліпідів у нальоті збільшується, це пов'язано зі збільшенням частоти розриву нальоту у людей. Однак дефіцит TRAF2 не впливає на вміст ліпідів в атеросклеротичних ураженнях (рис. 12). B 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/in TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/in TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/у TRAF2 +/-/LDLR -/- Позитивне фарбування олійно-червоним-O/розмір ураження цілої стінки судини (мм 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/у TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/in TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/in TRAF2 +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/in TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/in TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/in TRAF2 +/-/LDLR -/- Рис. 12: Дефіцит TRAF2 не впливає на Розмір все ще впливає на вміст ліпідів при атеросклеротичних ураженнях

66 Результати TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі TRAF6 не змінює склад атеросклеротичних уражень.Далі було перевірено гіпотезу, чи впливає TRAF6 на склад атеросклеротичних уражень. У людей це має наслідки для стабільності і, отже, для схильності до розриву атеросклеротичного ураження. Тому відповідно до дієти були підготовлені гістологічні зрізи, які фарбували для макрофагів (рис. 17А), для ліпідів (рис. 17Б), клітин гладких м’язів (рис. 17С), колагену (рис. 17Д) та Т-клітин (рис. 17Д) були. Виявляється, дефіцит TRAF6 не впливає на склад атеросклеротичного ураження, оскільки не було виявлено суттєвої різниці між трьома групами у всіх проведених фарбуваннях.

67 Результати TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі A Позитивна область Mac-3 (%) p = 0,23 p = 0,52 B Позитивна область олійно-червоного-O (%) p = 0,58 p = 0,98 C Позитивна площа α-актину (%) p = 0,95 p = 0,16 D picrosirius redpositive area (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 CD4 + клітини/стінка судини p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- у TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- у TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- у TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 Рис. 17: Дефіцит TRAF6 змінює наліт Композиція немієлоаблаційно опромінених мишей TRAF6 +/+/LDLR -/- отримувала або TRAF6 +/+/LDLR -/- (білі смужки, N = 21), або TRAF6 -/-/LDLR -/- стовбурові клітини (вилупилися бруски, N = 21). Мишей TRAF6 +/-/LDLR -/- відновлювали за допомогою TRAF6 -/-/LDLR -/- стовбурових клітин (чорні смуги, N = 22). Згодом усі групи отримували збагачену холестерином дієту протягом 18 тижнів, в кінці якої склад атеросклеротичних уражень в області коренів аорти визначався кількісно за допомогою імуногістохімічного фарбування. Результати для макрофагів (A), ліпідів (B), гладком'язових клітин (C), колагену (D) і Т-клітин (E) об'єднуються і відображаються як середнє значення ± SEM.

68 Результати TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі TRAF6 не впливає на атерогенез у низхідній аорті та в дузі аорти. Оскільки атеросклероз може по-різному розвиватися в різних точках судинної системи, низхідна аорта до біфуркації була проаналізована в анфасі після фарбування ліпідів, досліджених за допомогою Oil-Red-O. Як і очікувалося, не було відмінностей у черевній аорті між тваринами, у яких був дефіцит TRAF6 (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) або компетентність TRAF6 (20,5 ± 2, 6%, N = 8) трансплантували стовбурові клітини. Реципієнти TRAF6 +/-/LDLR -/-, які отримували дефіцитні TRAF6 гемопоетичні стовбурові клітини (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23), також мали подібний розподіл ліпідів, як контрольна група (рис. 18А та Б). У гістологічно проаналізованих дугах аорти тварини, яким трансплантували TRAF6-дефіцитні стовбурові клітини, також мають розміри нальоту, подібні до таких у контрольній групі (TRAF6 -/-/LDLR -/- у TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 мм 2, N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- у TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006 мм 2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- у TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 мм 2, N = 20, рис. 18 C і D).

69 Результати TRAF2 та TRAF6 при атеросклерозі Рис. 18: Дефіцит TRAF6 змінює розподіл ліпідів у черевній аорті та розмір атеросклеротичних уражень у дузі аорти, не опромінених мієлоаблативно TRAF6 +/+/LDLR -/- миші отримували або TRAF6 +/+/LDLR -/- (білі смужки, N = 8) або TRAF6 -/-/LDLR -/- стовбурові клітини (штриховані смужки, N = 8). Мишей TRAF6 +/-/LDLR -/- відновлювали TRAF6 -/-/LDLR -/- стовбуровими клітинами (чорні смуги, N = 10). Потім усі групи отримували дієту з високим вмістом холестерину протягом 18 тижнів, в кінці якої аналізували атеросклероз черевної аорти після фарбування Олієм-Червоним-О проти ліпідів на обличчі. Об'єднані результати представлені у вигляді Олійно-Червоний-O на загальну площу ± SEM (A); репрезентативні аорти фотографуються без збільшення у нижньому ряду (B). Після дієти були зроблені гістологічні зрізи дуг аорти та забарвлені Олійно-Червоним-O. Об'єднані розміри атеросклеротичних уражень ± SEM показані у верхньому ряду (C), нижче - репрезентативні гістологічні зрізи, пофарбовані олійно-червоним-O у 4-кратному збільшенні (D).