Гістологічні методи фарбування як інструменти аналізу їжі Можливості та межі
1 семінар з харчової гістології/56-й семінар з гігієни харчових продуктів GAP Гістологічні методи фарбування як інструменти для перевірки харчових продуктів Можливості та обмеження Контактна особа: Олександра Бартоломя Консультації та оцінка Тел .: +49 (2151) Факс: +49 (2151) Управління хімічних та ветеринарних досліджень Рейн-Рур-Вуппер AöR, Сторінка 1 Deutscher Ring 100, Інтернет Крефельда:
2 Звичайні методи гістологічного дослідження харчових продуктів Офіційний збір методів дослідження (ASU) згідно з 35 LMBG L (грудень 1989 р.) Визначення складу тканини м'яса, м'ясних виробів та ковбасних виробів Звичайні методи якісного та кількісного гістологічного дослідження Термін: Під тканинним значним складом м'ясних продуктів розуміли суму оброблених частин вбитих або вбитих теплокровних тварин. Клітини рослинного походження, які можна ідентифікувати, також можуть бути включені у висновки щодо суттєвої природи. Сторінка 2
3 способи фарбування згідно ASU L стор.3
4 Подальші методи фарбування стор.4
5 Принцип фарбування Каллехи: при пікриндіго-карміні в якості плазмового забарвлення різні компоненти тканин фарбуються по-різному; фарбування ядра проводиться швидким ядерним червоним Оцінка: Ядра клітин: червонувато-коричневі (інтенсивне ядерне фарбування важкодоступне) М'язи нагріті: світло-зелені, не нагріті: сильно-зелена до темно-зелена велика паренхіма, інші тканини: (світло) зелений колаген сполучна тканина нагріта: блідо-блакитна, не нагріта: синя еластична сполучна тканина: жовтий хрящ, кістки: синій сторінка 5
6 Фарбування Каллехи-Люголя = поєднання фарбування Каллехи та фарбування Люголя Використання у продуктах, що містять вуглеводи (наприклад, фрикадельки) Використання у зразках, які мають макроскопічно позитивний вплив на Люгольський принцип: крім того, вуглеводи (особливо нативний крохмаль) виявляються в Люголі Йод, що міститься у розчині, осідає у спіральних спіралях вуглеводів та відображає їх синім та чорним кольорами, щоб розрізнити крохмаль та подібні структуровані вуглеводи з -1,4-зв'язком з іншими вуглеводами, а амілазну обробку можна проводити на паралельних зрізах перед фарбуванням (0, 5% розчин амілази у фосфатному буфері протягом 2 годин) (історично: зразок слини) обробка амілазою служить для перевірки міцності паралельних ділянок, оброблених амілазою, що містять крохмаль, можна оцінити структури, попередньо покриті синьо-чорною товщиною
7 Фарбування Calleja (Люголя) Оцінка: органи та тканини показані як на фарбуванні Calleja, крім того, вуглеводи з - спіралі забарвлені в коричневий до чорного Результат після обробки амілазою: крохмаль та подібні структуровані вуглеводи зі сполукою -1,4 не виявляються або не відображаються на сторінці 7
8 Варіанти фарбування Каллеха (Люголя): огляд та диференціальне фарбування! кількісна оцінка шляхом додаткового обстеження багатьох тканин/органів (не печінки!) можливе виявлення та (напів) кількісне визначення кількості: скелетних, серцевих та язикових м’язів (включаючи ступінь подрібнення) сполучної тканини (колагенова/еластична сполучна тканина) кісткової тканини, хрящової тканини, судин, Залозиста тканина, лімфатична тканина, нервова тканина, шкірна слизова оболонка печінки, нирок, легенів та інших субпродуктів перероблене ковбасне м'ясо з оболонкою та без оболонки (можливі помилкові негативні результати) рослинні компоненти (наприклад, спеції, трюфелі) захист скупчень клітин рослин поляризаційним мікроскопом) сторінка 8
9 Фарбування Calleja (Люголя) Можливості: Індикація присутності немісних добавок Диференціація сировини та нагрітого матеріалу Виявлення крохмалю та аналогів вуглеводів з -1,4- зв'язком (лише фарбування Каллехи-Люголя) Індикація присутності вуглеводів у фарбування Каллехи-Люголя, якщо структури залишаються зафарбованими після обробки амілазою стор.9
10 Межі фарбування Каллехи (Люголя): залежно від ступеня нагрівання ядра клітин іноді не відображаються оптимально. Вуглеводи не виділяються в фарбуванні Каллехи. При фарбуванні Каллеха-Люголя виявлення KH пов’язане з певною структурою молекули KH Сторінка 10
11 Каллеха (Люголь), ковбаса для фарбування язика 25x сторінка 11
12 Каллеха (Люголь), ковбаса з язиком 100x сторінка 12
13 Калея (Люголь) фарбування вареної ковбаси 25x сторінка 13
14 Каллеха (Люголь) фарбування вареної ковбаси 100x сторінка 14
15 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 25x сторінка 15
16 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 100x сторінка 16
17 Каллеха (Люголь), що фарбує сиру ковбасу 25x сторінка 17
18 Каллеха (Люголь), що фарбує сиру ковбасу 100x сторінка 18
19 Каллеха (Люголь) забарвлення варена салямі 100x сторінка 19
20 Калея (Люголь) забарвлення варена салямі 100x сторінка 20
21 Каллеха (Люголь) забарвлення червоної ковбаси 25x сторінка 21
22 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 100x сторінка 22
23 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 100x сторінка 23
24 Calleja (Lugol) фарбування ковбаса з м'яса птиці 100x сторінка 24
25 Calleja (Люголь) забарвлення печінкової ковбаси 25x сторінка 25
26 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 25x сторінка 26
27 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси 100х сторінка 27
28 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси (Вінер) 100x сторінка 28
29 Каллеха (Люголь) забарвлення вареної ковбаси (Вінер) 100x сторінка 29
30 Фарбування гематоксилін-еозином (ВІН) Огляд фарбування, яке часто називають фарбуванням гемалом-еозином Принцип: Органні структури можна диференціювати шляхом фарбування ядер клітин гематоксиліном та цитоплазми еозином Оцінка: Клітинні ядра: синьо-фіолетовий Цитоплазма: рожева сторінка 30
31 Фарбування гематоксилін-еозином (ВІН) Можливості: підозрілі висновки, зроблені за допомогою плями Каллехи (наприклад, дані про серце, печінку, нирки, легені, шкірну слизову оболонку, шкіру птиці, шкірку), можна перевірити, оскільки ядра клітин та цитоплазма контрастують. Обмеження: у порівнянні Для фарбування Calleja сполучну тканину та м’язи важче диференціювати та кількісно визначати через відсутність кольорових контрастів Вуглеводи не виділяються. Рутинне використання паралельно фарбуванню Calleja не потрібно стор. 31
32 Фарбування гематоксилін-еозином (ВІН) печінкової ковбаси 100x сторінка 32
33 Просочення нітратом срібла відповідно до диференціального фарбування Kossa для виявлення кісткової тканини Принцип: зв’язаний кальцій у карбонатах і фосфатах обмінюється на іони срібла додаванням пірогалолу та перманганату калію, сполука срібла відновлюється до металевого срібла, значні концентрації кальцію зв’язуються лише в кістках, будь-які інші Розчинні іони кальцію вимиваються під час попередньої обробки зрізів Оцінка: Кісткові частинки: чорна Цитоплазма: червоно-коричнева Ядра клітин: червона сторінка 33
34 Просочення нітратом срібла за вареною ковбасою Kossa 100x сторінка 34
35 Трихромне фарбування за Пфайффером, Веллхаузером та Герою - S-фарбування алізарином Диференціальне фарбування для якісного та кількісного виявлення мінералізованих кісткових частинок Принцип: Під мінералізованою кісткою мається на увазі вміст кальцію кістковий матеріал (гідроксиапатит) з рН 4,3-4,5 кальцій кістки (а також інші двовалентні катіони (Mg, Al)) та алізарин S - захист яскраво-жовто-червоного хелатного з'єднання (кольоровий лак) (не описаний в ASU): додаткове фарбування ділянки, попередньо декальцинованої 5% азотною кислотою з того ж матеріалу Кісткові частинки набувають синього кольору решту тканини в декальцифікованому зрізі із збереженою морфологією, оскільки кальцій розчинений. Підрахунок кісткових частинок (не описаний в ASU): 10 зрізів або приблизно 40 см² досліджують для кількісного підрахунку (Bijker et al., 1984 ) Сторінка 35
36 Фарбування трихромом за Пфайффером, Веллхаузером та Герою - Алізарін S Оцінка: Кістки: червоний Хрящ: синій М’язи та сполучна тканина: синій Результат після лікування азотною кислотою: М’язи, сполучна тканина, демінералізовані кістки: синій Дуже великі кісткові частинки можуть бути витіснені з порізу під час різання, при розрізі залишається видима щілина. Демінералізація кісткових частинок (наприклад, за рахунок тривалого зберігання формаліну) Вміст кістки не можна переоцінити, а скоріше занизити сторінка 36
37 Трихромне фарбування за Пфайффером, Вельхаузером та Герою - фарбування ковбаси з птиці Alizarin S 25x сторінка 37
38 Трихромове фарбування згідно з Пфайффером, Веллхаузером та Герою - фарбування ковбаси з птиці Alizarin S 100x сторінка 38
39 Трихромне фарбування за диференціальним фарбуванням Шарвата для виявлення переробленої ошпареної ковбаси Принцип: колір визначає частинки диму (в оболонці та ковбасному м’ясі знизу). Колір показує поверхню ковбаси, змінену після копчення, і тканину, безпосередньо прикріплену до неї. Оцінка: краї копчених частин ковбаси: оранжево-червоний Решта частин препарату: сіро-зелені частинки переробленої ковбаси, як правило, більш ущільнені внаслідок дворазового нагрівання і не повністю інтегровані в м’ясо ковбаси, чим більше подрібнений матеріал подрібнений, тим складніше виявити сторінку 39
40 Трихромовий забарвлення за Шарватом Можливості: Залежно від інтенсивності куріння, показано оранжево-червоний шар завширшки мкм. Докази куріння також можна проводити після видалення оболонки (лущення кишечника) Обмеження: некурені натуральні кишечники (варені ковбаси, ковбаси каррі) неможливо показати Завдяки більшій товщині та наявним включенням у забарвленні Грокотта (чорний) або в поляризації пропущеного світла (спектральні кольори), перероблені частинки вареної ковбаси також можна розпізнати у кольорі Каллеха або Каллеха-Люголя завдяки ущільненій структурі та більш інтенсивному зеленому кольору! Сторінка 40
41 Трихромне забарвлення за вареною ковбасою "Харват" 100x сторінка 41
42 Трихромне забарвлення за вареною ковбасою "Чарват" 200x сторінка 42
43 Фарбування Calleja Lugol вареною ковбасою 25x сторінка 43
44 Фарбування Грокотта Диференціальне фарбування Срібна просочення використовується для виявлення вуглеводів з 1,2 діольними групами, напр. У загусниках, рослинних білкових препаратах та природних кишках рослинні білкові препарати містять залишки компонентів клітинної стінки (вуглеводи), які видно як включення в частинках білка завдяки забарвленню Грокотта Принцип: при просоченні сріблом за Грокоттом полісахариди виявляються з двома гідроксильними групами на сусідніх атомах вуглецю (1,2-діольні групи) вони приходять, наприклад у крохмалі борошно з гуару, борошно з ріжкового дерева, агар, альгінат, ксантан та похідні целюлози перед гідроксильними групами окислюються до альдегідів з хромовою кислотою, ці альдегідні групи відновлюють нітрат срібла і показуються коричнево-чорними, а потім тонованими хлоридом золота
45 Спеціальні плями: фарбування Грокотта Оцінка: Вуглеводи (КГ): чорні М’язи: рожевий Сполучна тканина: рожевий Рослинний білок: рожевий, якщо рослинний, тобто виявлені вуглеводівмісні білкові частинки, чорнокольорові вуглеводи зберігаються в рожевих білкових частинках, чим більш очищеними є рослинні білки, менше вуглеводів присутній і виявляється обробка амілазою для диференціації крохмалю та аналогічно структурованих вуглеводів з - 1,4-зв'язком інших вуглеводів, амілаза може бути проведена на паралельних розрізах перед фарбуванням. Результат після обробки амілазою крохмалем та аналогічно структурованими вуглеводами з α-1,4 посилання не виявляються сторінка 45
46 Фарбування Грокотта Можливості: Виявлення багатих білком рослинних борошнів та білкових препаратів Рослинні білкові препарати: соя, бавовняне насіння, люпин, ріпак, соняшник, пшениця, кукурудза, сочевиця, квасоля Морфологічні критерії: Борошно: Палісадна та годинникова скляні клітини соєвого борошна Білкові препарати: напр. TVP - губчаста структура пшеничної клейковини, тип соєвого білка, що скручується Обмеження: гідролізати, які не виявляються, типу рослинного білка визначити неможливо, морфологія дає підказки про походження сторінка 46
47 Ковбаса Grokott кольорова варена (Wiener) 200x сторінка 47
48 Бауер-Каллеха-Ф./Корабель періодичної кислоти s Reganz-F. (PAS) Диференційоване фарбування Обидва плями служать для виявлення вуглеводів з 1,2-діольними групами у рослинних білкових препаратах ТВП, що містять залишки компонентів клітинної стінки (вуглеводи), які видно як включення в білкових частинках. Фарбування Бауера-Каллехи проводять згідно з АСУ з окисленням хромовою кислотою: барвник пов'язується з 2 сусідніми вільними альдегідними групами, або ж менш агресивна періодична кислота може бути використана для окислення (= фарбування PAS) Принцип: виявляються полісахариди, в яких є дві гідроксильні групи на безпосередньо сусідніх атомах вуглецю (1,2 діольні групи) прийти напр. у крохмалі борошно з гуару, борошно з ріжкового дерева, агар, альгінат, ксантан та похідні целюлози перед гідроксильними групами окислюються до альдегідів з хромовою кислотою (пляма Бауера-Каллехи) або періодичною кислотою (PAS) сторінка 48
49 Бауер-Каллеха-Ф./Корабель періодичної кислоти s Reganz-F. (PAS) Оцінка: Вуглеводи: червоно-фіолетові м’язи: зелена еластична сполучна тканина: жовтий колаген. Сполучна тканина, хрящі, кістки: блідо-синій рослинний білок: обробка зеленою амілазою для диференціації крохмалю та аналогічно структурованих вуглеводів з - 1,4-зв'язком з іншими вуглеводами, обробка амілазою може проводитися на паралельних ділянках перед фарбуванням. Результат після обробки амілазою крохмалем та аналогічно структурованими вуглеводами з α -1,4-зв’язок неможливо виявити Можливості та обмеження: як із забарвленням Грокотта, сторінка 49
50 Корабель періодичної кислоти Reganz-F. (PAS) варена ковбаса (польська віденська) 200x сторінка 50
51 Висновки. Визначення складу тканин м’ясних продуктів та ковбасних виробів знову набуває значущості в останні роки; його не можна замінити сучасними аналітичними методами, оскільки метод прямого виявлення у багатьох питаннях є необхідним для визначення якісних, знижуючих та заборонених та задекларованих компонентів. забезпечує диференціацію, ідентифікацію та кількісну оцінку використовуваних інгредієнтів та надає інформацію про технологію виробництва. Відхилення від загального сприйняття широкої громадськості можуть бути наслідком використання незвичних тканин, збільшення ступеня подрібнення або частки вивільненого м’язового білка або додавання переробленого м’яса сторінка 51
52 Висновки Додавання не м’ясних інгредієнтів, таких як рослинні білкові препарати, загусники, високомолекулярні сполучнотканинні гідролізати або рослинні волокна, які потребують декларування або не дозволяються залежно від продукту, виявляються за допомогою спеціальних барвників. Як правило, для оцінки кольорових препаратів використовується мікроскопічна оцінка кольорових препаратів Calleja або Calleja-Lugol Товарність достатня! Сторінка 52
53 Дякую за увагу! Контактна особа: Олександра Бартоломя Консультації та оцінка Тел .: +49 (2151) Факс: +49 (2151) Управління хімічних та ветеринарних розслідувань Рейн-Рур-Вуппер AöR, сторінка 53 Deutscher Ring 100, Крефельд Інтернет: