Характеристика метаболічного статусу у нелюдських приматів з внутрішньовенною толерантністю до глюкози
Резюме
Метою цього протоколу є представити стандартний метод внутрішньовенних тестів на толерантність до глюкози (IVGTT) для здійснення контролю глікемії у приматів, які не є людьми, для оцінки та оцінки їх метаболічного стану від здорового до дисметаболічного.
Анотація
Вступ
IVGTT - це зручний функціональний аналіз, який зазвичай використовується для визначення функції β-клітин у людини в різних метаболічних умовах 5, 7. У тваринних моделях T2D це добре визнано як інструмент для характеристики тварин, які виявляють від прогресування метаболічного захворювання здоровий до дисметаболічного гіперглікемічний стан 8,9 Яскравими прикладами є макаки Cynomolgus. У цих тварин природним чином розвивається T2D з тими самими факторами ризику, що обумовлені віком та ожирінням, що сприяють його захворюваності, як і у людей 10. Крім того, спостерігається аналогічне прогресування захворювання та патологія підшлункової залози, що показує відкладення амілоїдів у міру прогресування дисметаболічної хвороби 11.
Тут ми повідомляємо про наш стандартний метод отримання IVGTT в NHP як частину нашої характеристики колонії метаболічного статусу у цих тварин. Цей метод простий у порівнянні з іншими, більш трудомісткими та дорогими Методами 2. IVGTT корисний для швидкої та частої характеристики великої колонії тварин. Враховуючи рівні глікованого гемоглобіну (HbA1C), раціон харчування та історію споживання їжі, а також відсоток м’язової маси та жиру в організмі, IVGTT зазвичай достатньо для характеристики 6 метаболічного стану тварини та прогресування до явного діабету 8.
HbA1C являє собою середній рівень глікемії протягом життя еритроцитів, забезпечуючи надійний показник рівня глюкози за останні шість тижнів до трьох місяців. Якщо вимірювати за зразком основи крові, який голодували на основі IVGTT, це значення забезпечує вікно в глікемічний контроль у місяці між процедурами. Якщо тварина перейшла з дисметаболічного з останнього IVGTT, значення HbA1c набагато вище, ніж їх попереднє діабетичне значення, означало б, що перехід розпочався незабаром після останнього IVGTT, тоді як значення HbA1c, ближче до попереднього значення, означало б, що вони нещодавно перейшли. Зазвичай у резус-макак рівні HbA1C, що перевищують 6%, є ненормальними і свідчать про поганий контроль рівня цукру в крові 10, 23.
Рівні глікемії слід інтерпретувати з точки зору поведінки та загального стану здоров’я тварини в цілому. Діабетичні макаки, як і люди, виявляють гіперфагію, полідипсію та поліурію. Групове утримання тварин представляє значні проблеми для вимірювання цих показників та індивідуального догляду, необхідного для дисметаболічних та діабетичних мавп. Ми рекомендуємо розміщувати тварин індивідуально, щоб можна було забезпечити більше особистого догляду та легше контролювати поведінкові маркери для здоров’я мавпи 8. Крім того, діабетичні макаки демонструють втрату ваги, підвищений ліпідний профіль (підвищений рівень холестерину, гіпертригліцеридемія) та порушення мінерального обміну в хімічній сироватці. Важливо виміряти маркери функції печінки та нирок у хімії сироватки крові, оскільки пошкодження цих органів часто прогресує внаслідок ускладнень метаболічного розладу/діабету і в сукупності може бути детермінантами глікемічного, ліпідного та мінерального дисбалансу 9, 11, 18, 24, .
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Усі процедури на тваринах Дослідницького інституту Девіда Х. Мердока IACUC, розташованого в дослідницькому містечку Північної Кароліни (NCRC), були затверджені згідно з Протоколом 14-017, що характеризує нечутливу модель діабету та переддіабету/резистентність до інсуліну та ефективність терапевтичних засобів для покращення чутливості до інсуліну. і метаболічної функції.
1. Відбір і підготовка тварин
2. Седація та підготовка тварин
ПРИМІТКА: Процедура IVGTT складається з 8 моментів забору крові за часом (Таблиця 1).
100 мг/дл вище рівня вихідного глюкози в плазмі натще.
4. Врятування тварин та обробка зразків
- Видаліть канюлі та надайте тиск на катетеризовані місця для гемостазу після закінчення часу T30 хв. Стежте за твариною, поки воно не прийде до тями і не сяде. Запропонуйте корм після того, як тварина повністю відновиться.
- Відразу після цього кожен зразок цільної крові знаходиться в пробірках K 2 EDTA на льоду. Центрифугуйте при 3000 обертах на хвилину при температурі 4 ° C протягом 10 хвилин збору. Аликвотні зразки плазми переносять у криовіани, заморожують і зберігають при -80 ° C до аналізу.
- Залиште кров у пробірці для сироватки для стандартного хімічного аналізу сироватки при кімнатній температурі не менше 20 хв і не більше 30 хв до центрифугування при 3000 об/хв при RT. Заморозьте зразки сироватки до вивчення протягом 48 годин після забору.
ПРИМІТКА: Цільна кров у холодильнику, зібрана для аналізу CBC, не пізніше ніж протягом 24 годин після забору Саєда.
- Залиште кров у пробірці для сироватки для стандартного хімічного аналізу сироватки при кімнатній температурі не менше 20 хв і не більше 30 хв до центрифугування при 3000 об/хв при RT. Заморозьте зразки сироватки до вивчення протягом 48 годин після забору.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Результати в ілюстрація 1 Показані показові типові криві глюкози та інсуліну у зрілих, здорових та діабетичних макак циномольгуса протягом 30 хвилин IVGTT. Дані здорових та просунутих мавп з діабетом протиставляються очевидним відмінностям між тваринами з двох крайніх меж діапазону метаболічної характеристики. Цей протокол IVGTT був успішно використаний авторами в резус-макаках із подібними результатами.
Базові рівні глюкози натощак здорової макаки (резус та циномольгус) можуть бути на рівні від 50 до 60 мг/дл 8. Як показано на малюнку, початкова екскурсія глюкозою, виміряна при Т3, для здорового NHP може не піднятися настільки високо, як типове значення глюкози для діабетичної тварини, яке часто перевищує 200 мг/дл. Протягом наступних тридцяти хвилин рівень глюкози часто повертається до вихідного рівня у здорової тварини, тоді як дисметаболічні та діабетичні тварини цього не роблять (Ілюстрація 1; суцільні лінії). Супутня крива інсуліну для здорової тварини показує два піки (Ілюстрація 1; синя пунктирна лінія), що відповідає початковому, швидкому зниженню рівня цукру в крові (фаза 1), опосередкованому більшою, ніж нормальна частина, периферичним впливом інсуліну на транспорт і споживання глюкози 3, 4. величина цих периферичних ефектів, навіть протягом першого Фаза зниження інсулінової реакції не дорівнює внеску печінки в глюкозу, яка під час меншого, але стійкого другого піку інсуліну (фаза 2) має найбільший вплив на рівень глікемії через придушення вироблення ендогенної глюкози 1.
У міру того, як тварина переходить до дисметаболічного стану від здорового, як правило, у першій фазі зменшується відповідь інсуліну на болюс декстрози, який у зниженому повітря може бути відображено. Однак AUC залишатимуться незмінними, оскільки загальне збільшення виробництва інсуліну буде частіше, забезпечуючи майже незмінні рівні глікемії протягом процедури, оскільки збільшене вироблення інсуліну компенсує зниження чутливості. Як тільки тварина стає явно діабетиком, виробництво інсуліну різко падає у відповідь на болюс декстрози (1; пунктирна червона лінія). Глікемічний рівень залишатиметься підвищеним протягом процедури, як і те, що кліренс глюкози зараз відбувається майже повністю за допомогою інсулінонезалежних механізмів (1), передається.
| Час | Час (хв) | Реальний час | Кількість проби крові (мл) | Аналіз - приклад | Показання глюкози (мг/дл) | |
| Базова лінія | 5 мл | 1,5 мл SST - хімія 0,5 мл K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 мл K 2 EDTA + 50 мкл Prot -. Глюкоза, інсулін, C-Pep | ||||
| 0 | Інфузія декстрози 250 мг/кг внутрішньовенно внутрішньовенно протягом 30 с, потім 5 мл сольового розчину гепарину | |||||
| 3 | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 7-й | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 15-й | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 20-го | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 30-й | 2,0 мл | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
таблиця 1:. Таблиця процедур IVGTT Показано стандартний звіт про процедуру IVGTT, що включає всю відповідну інформацію під час процедури. Час для зразків аспірацій після інфузії декстрози слід обчислювати з кінця інфузії. Фактичний час слід реєструвати для кожного розіграшу. Клацніть тут, щоб завантажити цю таблицю як документ Microsoft Word .
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
IVGTT оцінює здатність стимульованого глюкозою вивільнення інсуліну за допомогою одноразової інфузії декстрози на основі маси тіла 5, 12, 13. За результатами тесту досягається рівень цукру в крові та інсуліну натще, і це дозволяє оцінити здатність тварини виділяти інсулін та повертає підвищений рівень глюкози до вихідного рівня. Це надає користувачеві інформацію для характеристики тварини як нормального здорового контролю рівня глюкози та інсуліну, гіперінсулінемічної дисметаболічної тварини з нормоглікемією або гіперглікемічної інсулінорезистентної діабетичної тварини.
IVGTT обмежені їх здатністю безпосередньо вимірювати чутливість до інсуліну. Це насамперед корисно як метод оцінки вироблення інсуліну та кліренсу глюкози. Однак екстракція печінкового інсуліну з портального кровопостачання погіршує вимірювання "секреції інсуліну" із системного кровопостачання. Однак це можна частково подолати, вимірявши С-пептид, який виділяється в еквімолярних кількостях з підшлункової залози, але не виводиться печінкою до надходження загального кровопостачання. Це дає кращий огляд виробництва інсуліну для оцінки кращої функції β-клітин 16. IVGTT також не розрізняють інсулінозалежних механізмів кліренсу глюкози та неінсулінозалежних механізмів 1, 6. Хоча чутливість до інсуліну можна оцінити побічно шляхом мінімального моделювання даних IVGTT, більш надійних заходів можна досягти за допомогою таких методів, як градуйоване вливання глюкози (GGI), який забезпечує 14 - криву дозу-відповідь β-клітин, 15.
Однак чутливість до інсуліну оцінюється лише опосередковано за допомогою GGI. Стандартну дозу інсуліну можна вводити тварині під час IVGTT для поліпшення оцінки чутливості до інсуліну, але це буде маскувати ендогенне вироблення інсуліну від погіршення оцінки функції β-клітин. Методи гіперглікемічного та гіперінсулінемічного затискачів безпосередньо вимірюють регуляцію глюкози за допомогою контрольованого впливу інсуліну. Недоліком як GGI, так і затискачів є те, що вони дорогі у виконанні і вимагають більшої робочої сили та часу (іноді до шести-восьми годин, залежно від конструкції процедури). IVGTT, з іншого боку, може можна проводити менше години і з мінімальними витратами праці.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори активно пов'язані з контрактним науково-дослідним інститутом (Crown Bioscience) у галузі метаболічних захворювань.