Кількісне визначення атеросклерозу у мишей (переклад на німецьку)

Резюме

Мишачі моделі атеросклерозу є корисними інструментами для вивчення патогенних шляхів на молекулярному рівні, але вимагають стандартизованої кількісної оцінки розвитку ураження. Цей протокол описує оптимізований метод визначення розміру ураження основних артерій, включаючи корінь аорти, дугу аорти та брахіоцефальну артерію.

Анотація

Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті у світі. У більшості випадків основною причиною є атеросклероз, який частково є хронічним запальним захворюванням. Експериментальні дослідження атеросклерозу з’ясували роль холестерину та запалення в процесі захворювання. Це призвело до успішних клінічних випробувань активних фармацевтичних інгредієнтів, які зменшують клінічні прояви атеросклерозу. Ретельні та добре контрольовані експерименти на мишачих моделях захворювання можуть додатково з’ясувати патогенез захворювання, який до кінця не вивчений. Стандартизований аналіз уражень важливий для зменшення експериментальної мінливості та збільшення відтворюваності. Визначення розміру ураження в корені аорти, дузі аорти та брахіоцефальній артерії є загальними кінцевими точками експериментального атеросклерозу. Цей протокол надає технічний опис для оцінки атеросклерозу на всіх цих ділянках в одній миші. Протокол особливо корисний, коли матеріал обмежений, як це часто буває при характеристиці генетично модифікованих тварин.

Вступ

Серцево-судинні захворювання є основною причиною смертності у світі з ішемічною хворобою серця та інсультом, що припадає на кожну четверту смерть1. Більшість випадків спричинені атеросклерозом, захворюванням, що характеризується повільним накопиченням ліпідвмісних бляшок з ознаками хронічного запалення у великих та середніх артеріях 2. Захворювання зазвичай залишається непоміченим протягом декількох десятиліть, поки розрив або ерозія нальоту не спричиняє артеріальний тромбоз, що призводить до ішемічного пошкодження тканин.

Нормальна артерія складається з інтимного шару з ендотеліальними клітинами та малорозподіленими гладком'язовими клітинами, медіашару з гладком'язовими клітинами та еластичними ламелями та навколишнього адвентиційного шару з пухкою сполучною тканиною 3. Інтимне утримання ЛПНЩ компенсує розвиток атеросклерозу 4. Накопичення та модифікація ліпопротеїдів призводить до агрегації та захоплення в артеріальній інтимі 5. Запальну реакцію викликають захоплені та модифіковані ліпопротеїни 6. Ендотеліальні клітини починають експресувати молекули адгезії, такі як VCAM-1, на ділянках в артеріальному дереві з бурхливим кровотоком, що призводить до набору циркулюючих моноцитів та інших лейкоцитів 7. Проникаючі моноцити диференціюються в макрофаги, які поглинають ліпіди з подальшим перетворенням у пінні клітини макрофагів 8 .

Атеросклероз вивчався на моделях мишей із збільшенням частоти з середини 1980-х. C57BL/6 є найбільш часто використовуваним інбредним штамом миші для цих досліджень, і він використовується як генетичний фон для більшості генетично модифікованих штамів 9. Цей штам був заснований у 1920-х роках 10, а його геном був опублікований 11 у 2002 році. Експерименти на мишачих моделях мають ряд переваг: колонії швидко розмножуються, житло економить простір, а інбридинг зменшує експериментальну мінливість. Модель також дозволяє генетичні маніпуляції, такі як цілеспрямовані делеції генів та інсерція трансгенів. Це призвело до нового патофізіологічного розуміння захворювання та нових терапевтичних цілей 12.

Миші дикого типу C57BL/6 природно стійкі до артеріосклерозу. У них більша частина циркулюючого холестерину в ЛПВЩ, а складні атеросклеротичні ураження не утворюються навіть при харчуванні з високим вмістом жиру та високим вмістом холестерину 13. Тому гіперхолестеринемічні миші, такі як Apoe -/- на фоні C57BL/6, використовуються як експериментальні моделі атеросклерозу 14, 15. Відсутність ApoE погіршує засвоєння печінкою залишкових ліпопротеїдів і суттєво порушує ліпідний обмін. У апое -/- мишей циркулюючий холестерин в основному циркулює в частинках ЛПНЩ, і миші розвивають складні атеросклеротичні бляшки на регулярній дієті Чау.

Ldlr -/- миші імітують розвиток артеріосклерозу у людей з сімейною гіперхолестеринемією 16. Мишам Ldlr -/- потрібна західна дієта, щоб виробити такий вид 17. Західні дієти, що імітують споживання людиною, зазвичай містять 0,15% холестерину. Рецептор LDL розпізнає ApoB100 та ApoE та опосередковує поглинання частинок LDL через ендоцитоз. Рецептори ЛПНЩ мають фундаментальне значення для очищення печінки ЛПНЩ від кровообігу, тоді як експресія рецепторів ЛПНЩ у клітинах кровотворення не впливає на цей процес. Це відкриває можливість трансплантації кісткового мозку клітин Ldlr +/+ при гіперхолестерині Ldlr -/- реципієнта та оцінку розвитку артеріосклерозу. Химери кісткового мозку широко використовуються для вивчення участі гемопоетичних клітин в експериментальному атеросклерозі. Однак трансплантація кісткового мозку може вплинути на розмір і склад атеросклеротичних бляшок, роблячи тлумачення результатів неоднозначним.

Для вивчення конкретних процесів захворювання 18 були розроблені різні варіанти мишей Apoe -/- та Ldlr -/- з додатковими генетичними модифікаціями. Прикладом можуть служити миші, трансгенні для людини APOB100 -/- (HuBL), які несуть повний людський ген APOB100 19, 20. Ці миші розвивають гіперхолестеринемію та атеросклероз на регулярній дієті чау. Однак розвиток складних атеросклеротичних бляшок займає щонайменше півроку, і в коротших експериментальних протоколах зазвичай використовують західні дієти 21. Велика частина холестерину в плазмі циркулює в частинках ЛПНЩ, що надає мишам HuBL більш дисліпідемічний ліпопротеїновий профіль людини порівняно з мишами Apoe -/- та Ldlr -/-. Миші HuBL також дозволяють досліджувати людський ApoB як аутоантиген 22 .

На мишачих моделях атеросклерозу розвиваються складні атеросклеротичні бляшки із загальними ознаками захворювань людини. Однак бляшки досить стійкі до розриву з подальшим інфарктом міокарда. Атеротромбоз лише спорадично доведений та експериментально складний для оцінки 23, 24, 25. Були розроблені спеціальні моделі руйнування нальоту, але в дослідному полі відсутня надійна і відтворювана модель для оцінки стабілізаторів нальоту.

Кількісне визначення атеросклерозу багато в чому повідомляється в літературі. Недавні зусилля спрямовані на стандартизацію експериментального проектування, проведення та звітування досліджень на тваринах 26. Слідчі мають різні уподобання та методи, адаптовані до їх лабораторій. Більшість дослідницьких проектів також унікальні таким чином, що вони вимагають деяких змін протоколу. Через багатофакторний характер захворювання оптимальні засоби контролю залежать від проекту до проекту. Місцеві умови та відсутність стандартизації можуть призвести до виявлених відмінностей у розвитку хвороб, що заважає прогресу в галузі досліджень. Відмінності експериментальної мінливості також означають, що статистичні розрахунки ефективності повинні базуватися на пілотних дослідженнях у місцевих умовах.

Кількісна оцінка артеріосклерозу рекомендується в кількох місцях на судинному дереві. Цей протокол описує, як отримати результати з кореня аорти, дуги аорти та брахіоцефальної артерії у однієї миші, а також залишити решту грудно-черевної аорти для інших аналізів. Препарати на обличчі дозволяють швидко визначити навантажені бляшками ліпідів в дузі аорти. Важкість захворювання в брахіоцефальній артерії також може бути визначена кількісно, коли ретельно візуалізуються зразки. Більш трудомісткий переріз кореня аорти залишає кілька ділянок для детальної оцінки складу нальоту.

Протокол

Усі експерименти на тваринах потребують схвалення етичних органів.

1. Мишача жертва та мікродисекція аорти

Малюнок 1: Серце та дуга аорти in situ. (А.) Легкі, трахею, стравохід і тимус видаляють для відображення дуги аорти in situ у 20-тижневої самки миші апое -/- на звичайній дієті чау на мікрофотографії, шкала шкали = 2 мм. Пунктирними лініями вказано, де зрізати дугу аорти та її гілки. (B.) Схематичне зображення серця та аорти. Пунктирна лінія червоним кольором вказує, де слід вирізати серце перед тим, як коріння аорти буде кріомонтано. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

2. Аналіз обличчя артерії аорти та брахіоцефальної артерії

Рисунок 2: Кількісне визначення атеросклеротичного ураження. (А.) Дуга аорти 20-тижневої людини-чоловічої особини APOB100-трансгенної Ldlr -/- (HuBL) миші, яку годували західною дієтою протягом десяти тижнів, прикріплювали і фарбували Суданом IV на багаті ліпідами бляшки. Вся область дуги аорти на мікрофотографії виділена пунктирною лінією білого кольору, смужка шкали = 2 мм. Пунктирними лініями жовтим виділено загальну площу брахіоцефальної артерії. (B.) Переріз кореня аорти на відстані 400 м від синуса аорти у 20-тижневого самця Ldlr -/- західної дієти, яку годували мишами протягом восьми тижнів, візуалізували на мікрофотографії, шкала = 500 м. Пунктирними лініями чорним кольором намічається вся судинна область та атеросклеротичні ураження, забарвлений олійно-червоним О і розташований в артеріальній інтимі. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

3. Кріосекція кореня аорти

Рисунок 3: Організація слайдів для серійних зрізів кореня аорти. Під час кріосекції кореня аорти слід збирати кожні 10 м товщини ділянки, що простягається на перші 800 м висхідної аорти. Систематична організація слайдів потрібна для отримання відповідних розділів для різних цілей. Аналіз складу уражень, як правило, включає фарбування маслом червоного O для ліпідів та фарбування Picrosirius червоним кольором колагену. Решта зрізів збирають і фіксують ацетоном для імуногістохімії та імунофлюоресцентного фарбування. Цей показник змінено з Gistera et al 30. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

4. Фарбування маслом червоного O та кількісне визначення атеросклерозу в коренях аорти

Репрезентативні результати

Oil Red O - це жиророзчинний яскраво-червоний барвник disazo, який забарвлює нейтральні ліпіди. Полярні ліпіди в клітинних мембранах не фарбуються. Масляно-червоне фарбування O можна проводити на свіжих, заморожених або зафіксованих у формаліні зразках, але не на зразках, вкладених у парафін, завдяки видаленню ліпідів у процесі депарафінізації. Кількісне визначення накопичення ліпідів з ураженням може бути проведено за кольоровим набуханням олійно-червоного О-позитивного ділянки всієї зони ураження (Малюнок 4С). Гематоксилін утворює синю пляму на ядрах клітин, що допомагає візуалізувати морфологію нальоту. Права і ліва коронарні артерії зазвичай відхиляються від аорти на 250 м від аортального синуса 27, що часто збігається з найбільш помітними розмірами ураження. Поперечні зрізи цього регіону часто відображаються як репрезентативні результати (Рисунок 4D).

Oil Red O можна використовувати для фарбування приготованих на обличчі аорт, але цей протокол використовує Судан IV, інший зручний жиророзчинний барвник дизазо. Судан IV чітко візуалізує атеросклеротичні бляшки в оранжево-червоному кольорі шляхом фарбування ліпідів, тригліцеридів та ліпопротеїдів. Видалення темного тла на репрезентативних зображеннях дуг аорти en face може покращити візуальне зображення (рис. 5А). Зазвичай розмір ураження поділяють на групи, що дозволяє проводити статистичне тестування за допомогою t-критерію студента між групами. Графічний розкид, який показує як окремих мишей, так і середнє значення, що порівнюється між групами, є інформативним способом перегляду результатів (Малюнок 5B-C). Оскільки варіація в межах груп зазвичай відрізняється між положеннями судинного дерева, зазвичай потрібні окремі розрахунки ефективності. Непотрібних відхилень можна уникнути за допомогою методичної компетентності та стандартизації протоколів. Отримання статистично значущих результатів є важливим, але завжди слід враховувати біологічну значимість спостережуваної різниці.

Малюнок 5: Атеросклеротичні ураження дуги аорти та брахіоцефальної артерії. (А.) Представницькі мікроскопи дуг аорти на лицях із вмістом ліпідів бляшками, забарвленими Суданом IV (оранжевим кольором) від 20-тижневих мишей, що годували західну дієту протягом десяти тижнів, візуалізували разом. Шкала шкали = 2 мм. Людських APOB100-трансгенних мишей Ldlr -/- (HuBL) використовували в якості контролю, а експериментальну групу складали TCR-трансгенні миші з LDL-реактивними Т-клітинами (BT1), схрещеними для формування мишей HuBL. (B.) Атеросклеротичні ураження в дузі аорти (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; t-тест Шулера). (C.) Атеросклеротичні ураження брахіоцефальної артерії (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, t-тест Стьюдента). (B.-C.) Крапки представляють окремих мишей, стовпчики позначають середнє значення "SEM. * P - 0,05". Ця цифра взята від Gistera et al. 32 змінено. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Додатковий малюнок 1: Альтернативна організація слайдів для серійних зрізів кореня аорти. Спрощена систематична організація слайдів для збору зрізів з кореня аорти. Колекція забезпечує фарбування маслом червоного кольору O на ліпіди та імуногістохімічне або імунофлюоресцентне фарбування. Спеціальні слайди для червоного фарбування колагену Picrosirius опущені. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Обговорення

Розкриття інформації

Авторам нічого розкривати.

Подяка

Ми дякуємо всім колишнім членам експериментального відділу досліджень серцево-судинної системи Герана К. Ханссона, які сприяли розробці цього протоколу за останні чверть століття. Ми особливо вдячні за внески Антоніно Ніколетті, Сінхуа Чжоу, Анни-Карін Робертсон та Інгер Бодін. Ця робота була підтримана грантами проекту 06816 та підтримкою Ліннея 349-2007-8703 від Шведської дослідницької ради та грантами Шведського фонду серця і легенів, Ради округу Стокгольм, Фонду професора Нанні Сварц, Лоо та Ганса Остермана. Фонд медичних досліджень, Науковий фонд Каролінського інституту та Фонд геріатричних хвороб Інституту Каролінської.