Колекція дихання від дітей щодо захворювання Протокол виявлення біомаркерів (переклад німецькою мовою)

Резюме

Цей протокол описує простий спосіб отримання зразків дихання у дітей. Коротше кажучи, зразки змішаного повітря попередньо концентрують у сорбентних пробірках перед проведенням газової хроматографії-аналізу мас-спектрометрії. Біомаркери дихання інфекційних та неінфекційних захворювань можна ідентифікувати за допомогою цього методу збору дихання.

Анотація

Вступ

Біомаркери можуть нести цінну інформацію про нормальні та патологічні біологічні процеси, які можуть сприяти клінічно ідентифікованому захворюванню. Останнім часом зростає інтерес до оцінки фітонцидів дихання як біомаркеру для різних захворювань, включаючи інфекції, порушення обміну речовин та рак 1. Видихуване повітря містить кількісно вимірювані леткі органічні сполуки (ЛОС), напівлетучі органічні сполуки та похідний від мікробів матеріал (наприклад, нуклеїнові кислоти від бактерій та вірусів). Основною метою аналізу видихуваного повітря є неінвазивне розуміння стану захворювання та/або впливів навколишнього середовища. Існує кілька методів збору та аналізу видихуваного повітря залежно від складових, що цікавлять. В даний час не існує стандартизованого методу обстеження видихуваного повітря, який ускладнює порівняльний аналіз результатів досліджень. Стандартизація процедури відбору дихання є важливою, оскільки сама процедура відбору проб має значний вплив на результати дихання, що знаходяться нижче за течією.

У багатьох дослідженнях використовується проба пізнього дихання із пізніх дихальних шляхів 2, 3. Цей вибір включає відкидання першої частини видихуваного повітря ("мертвий простір"), щоб переважно захопити повітря в кінці циклу дихання. Перевага цієї стратегії полягає в тому, що вона мінімізує рівень екзогенних ЛОС (наприклад, екологічних ЛОС), одночасно збагачуючи ендогенними ЛОС, специфічними для пацієнта. Цей метод запобігає видиху особини протягом перших декількох секунд перед тим, як взяти зразок дихання. Інші дослідники використовували датчик тиску для активації відбору проб у заздалегідь визначеній фазовій послідовності 4, 5. Оскільки датчики тиску вимагають складної технології, цей альтернативний метод вимагає спеціального та відносно дорогого обладнання для відбору проб.

Відбір зразків дихання у дітей може бути особливо складним. Найбільше занепокоєння викликає те, що маленькі діти можуть не працювати з колодами для добровільного видиху повітря "мертвим простором". Через це легше отримати змішане дихання дихальних шляхів від дітей. Однак важливим обмеженням для змішаних зразків дихальних шляхів є ризик забруднення навколишнього середовища та матеріалів. Тому доцільність дитячого збору є основною проблемою на місцях.

На додаток до методів збору даних, утримання зразків дихання також може вплинути на якість зразка. Висока вологість повітря при диханні видихає і наднизькі концентрації (частин на трильйон) летких органічних сполук роблять зразки дихання диханням особливо схильними до проблем, пов’язаних з пам’яттю 6, 7. Незважаючи на великий потенціал таких технологій в режимі реального часу, як реакція переносу протонів-мас-спектрометрія (PTR-MS), GC-MS залишається золотим стандартом для аналізу зразків дихання. Оскільки GC-MS аналіз зразків дихання є офлайн-технікою, він поєднується з такими методами попередньої концентрації, як пробірки термічної десорбції (TD), екстракція мікротвердої фази та пристрої для утримання голки. Зразки дихання необхідно тимчасово зберігати в полімерних мішках 8 перед попередньою концентрацією. Полімерні сумки популярні завдяки своїй помірній ціні, відносно хорошій довговічності та багаторазовому використанню. Хоча мішки можна використовувати повторно, для ефективного очищення потрібні час та зусилля 7, 8. Кожен конкретний пакет також вимагає емпірично визначених та стандартизованих процедур контролю якості, повторного використання та відновлення.

TD-пробірки широко використовуються для попередньої концентрації дихання, оскільки вони захоплюють велику кількість фітонцидів і можуть бути налаштовані. Абсорбуючі матеріали, що використовуються для упаковки пробірок TD, можуть відповідати певним застосуванням та певним цільовим фітонцидам, що представляють інтерес. TD-пробірки значно покращують дослідження біомаркерів комфорту дихання, особливо на віддалених пасовищах, оскільки TD-пробірки безпечно зберігають летючі речовини, що дихають, принаймні протягом двох тижнів і їх легко транспортувати 3 .

Прагнучи стандартизувати педіатричну колекцію дихання для виявлення біомаркерів, ми описуємо тут простий метод збору дихання у дітей. Щоб проілюструвати репрезентативні результати впроваджених протоколів, анонімні дані представлені постійній когорті дітей (8-17 років) при оцінці неалкогольної жирової хвороби печінки (НАЖХП). Повні результати та аналіз цього дослідження будуть повідомлені у наступній публікації. Роблячи це, ми звітуємо про підмножину даних, щоб продемонструвати застосування нашого протоколу. Коротше кажучи, дітям пропонується нормально видихати через мундштук у полімерний мішок, ніби «дмухаючи повітряну кулю». Процес повторюють 2-4 рази, поки не буде зібрано 1 л вдиху. Потім зразок переносять у пробірку TD і зберігають при 5 ° C до аналізу GC-MS.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Дослідження було схвалено Інституційною комісією з медичного факультету Університету Вашингтона (# 201709030). Згода була отримана від батьків або законного опікуна до зарахування до дослідження. Фотографії на малюнку 2 відтворюється за письмовою згодою батьків.

(3) Передача дихання в термодесорбційні трубки

1. Збирайте зразки навколишнього повітря навколо пацієнта відразу після вдиху.
   1. Покладіть мішок на вихід насоса зі шлангом, як в додаткова цифра 5показано.
   2. Складіть шток клапанного мішка вниз, щоб відкрити впускний вузол для відбору проб.
   3. Зафіксуйте відкритий клапан, повернувши накатний гвинтовий гвинт збоку впускного штуцера за годинниковою стрілкою.
2. Увімкніть насос і працюйте зі швидкістю 100 мл/хв протягом 12 хв. Насос буде збирати 1200 мл навколишнього повітря.
3. Після того, як бажаний об’єм зібраний, ослабте накатчастий накатний гвинт збоку впускного вузла, повернувши його проти годинникової стрілки, і штовхайте шток клапана, доки впускний штуцер не закінчиться.
4. Зафіксуйте кишеньковий клапан, повернувши за годинниковою стрілкою накатний гвинт на боці вхідного штуцера, закритого за годинниковою стрілкою.
5. Від'єднайте мішок від насоса.
6. Ті самі дії, що і в розділі 3. Єдина відмінність полягає в тому, що навколишнє повітря, леткі органічні сполуки переносяться, а не дихальні.

ПРИМІТКА: Умови для аналізу зразків дихання та повітря описані в 9.

1. Проаналізуйте зібрані дані та ідентифікуйте сполуки на хроматограмах. Використовуйте типові програми, щоб знайти та встановити всі підключення, зроблені приладом (Рисунок 3A) визнано. Наприклад, функція деконволюції для ідентифікації сполук. Дані фільтра з коефіцієнтом розміру вікна утримування 80, фільтром висоти маси ≥100 підрахунків та складеним фільтром абсолютної площі ≥500 підрахунків.
2. Використовуйте хімічні стандарти для ідентичних сполук у зразках дихання та повітря. Витягніть площу піку основного іона сполук, що нас цікавлять, таких як ізопрен та β-пінен (рис.4) і порівняти рівні летких у диханні та повітрі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

У нашому дослідженні зразки дихання, зібрані у 10 дітей (8-17 років), наразі оцінювались у дитячій лікарні Сент-Луїса. Зразки дихання та навколишнього повітря (n = 10) відбирали, як описано вище. Зразки аналізували за допомогою газової хроматографії, квадрупольної мас-спектрометрії часу прольоту (GC-QToF-MS) та термічної десорбції, як описано вище 9. Після видалення фонових забруднень, впроваджені протоколи призвели до отримання в середньому 311 летких органічних сполук (ЛОС) у кожній із змішаних проб повітря, що видихається. У середньому виявлено значно більше ЛОС у зразках дихання порівняно з контролем навколишнього середовища/навколишнього середовища (311 ± 11,5 проти 190 ± 12,6, p Рис. 3A). Збільшена кількість ЛОС у диханні, порівняно з навколишнім повітрям, чітко вказується на репрезентативних загальних іонних хроматограмах (ТІК) (рис. 3 b) порівнювати.

Як показник успішного контролю якості збору дихання, рівні двох ЛОС загального дихання (ізопрену та β-пінену) порівняно з регуляторами повітря Циммера (Рисунок 4). Ізопрен, один з найпоширеніших ЛОС у диханні, зазвичай міститься в рівнях на мільярд (ppb) (131 ppb), тоді як β-пінен міститься в рівнях sub-ppb (0,59 ppb) 6. Обидва сполуки встановлені в диханні здорових дорослих порівняно з низьким рівнем повітря у приміщенні, що вказує на те, що нормальні фізіологічні процеси збагачуються як основне джерело цих аналітів у вдиху 6. На той час ізопрен (m/Z 67) утримувався 2,12 хвилини, а β-пінен (m/Z 93) - 14,4 хв. Ми виявили, що кількість зразків дитячого дихання із ізопрену в 10 разів вища, ніж у кімнатних регуляторах повітря (рис.4; середня наповненість ± SEM становить 4,2x10 5 ± 1,0x10 5 та 3,9x10 4 ± 0,9x10 4 для дихання та повітря та p = 0,0003), а β-пінен демонструє в 3 рази вищу наповненість дихання, ніж повітря (моя наповненість ± SEM становлять 3,0x10 4 ± 1,3x10 4 та 9,1x10 3 ± 1,6x10 3 для дихання та повітря відповідно p = 0,007), що підтверджує успішне збирання дихання. Повний описовий аналіз результатів дослідження Biomarker Discovery цього дослідження буде представлений у наступній публікації.

Рисунок 1: Пробовідбірник дихання та мішок для збору видихуваного повітря разом. Пробовідбірник дихання (із відкритим синім клапаном, тобто позначений двосторонньою червоною стрілкою паралельно штекеру) та мішок, з'єднаний шлангом, готовий до вдиху. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 2: Дихання, що видихає дитина, у мішку для збору дихання. (А.) Дитина, що затримує пробу, робить видих і (B.) пропонує зразок дихання в кишені. Фото ввічливості. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 3: Летючі речовини, що видихаються. (А.) Кількість різних летких сполук у кожному зразку дихання у педіатричних пацієнтів (n = 10) та контролів навколишнього повітря (n = 10). Відображаються середні значення та стандартні помилки середнього значення (SEM). (B.) Загальний іонний хроматограф (TIC) репрезентативних дитячих зразків дихання проти контролю повітря для візуалізації. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 4: Рясність двох летких речовин, що видихаються. Велика кількість ізопрену та β-пінену у зразках дихання у педіатричних пацієнтів (n = 10) та регуляторах повітря Циммера (n = 10). Повнота кількісно визначається площею піку іонної основи. Відображаються середнє значення та SEM. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Додатковий малюнок 1: Пробовідбірник дихання. Зліва: (A) Пробовідбірник дихання складений разом: 1) чоловічий адаптер + роз'єм (2) двосторонній кульовий кран + 3) тефлоновий чоловічий адаптер. (B) Картонний мундштук. (C) шланг малого та великого діаметру. Справа: пробовідбірник дихання з приєднаним мундштуком та трубками. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Додаткова фігура 2: Різні об'єми дихання. Вище зображені колекційний мішок, наповнений різною кількістю повітря (1 л, 2 л і 2,5 л), як візуальне зображення приблизних об'ємів дихання, які потрібно зібрати. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Додатковий малюнок 3: Клапан на кишені. Зліва: шток клапана опущений (кишеньковий клапан відкритий). Зафіксуйте кишеньковий клапан, повернувши за годинниковою стрілкою накатний гвинт на боці вхідного штуцера, закритого за годинниковою стрілкою. Мішок готовий набрати подих. Справа: шток клапана знаходиться вгорі (закрита кишеня клапана). Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Додатковий малюнок 4: Передача дихання. Зліва: сорбентна трубка (1), прикріплена до одного кінця мішка трубкою малого та великого діаметру, а інший кінець до насоса. Праворуч: зверніть увагу на жолобчастий кінець на трубці сорбенту; рифлений кінець повинен спрямовувати до колекційного мішка. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Додатковий малюнок 5: Збір навколишнього повітря. Зліва: Насос із двома з'єднаннями: вхідним і вихідним. Вихідний отвір входить до комплекту сумки. Вхідний отвір буде втягувати навколишнє повітря і переносити його в мішок. Справа: Налаштована система збору атмосферного повітря. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Незважаючи на значний прогрес у дослідженнях дихання за останнє десятиліття, стандартизовані процедури відбору проб та аналізу летючого дихального газу залишаються невизначеними 10. Однією з основних причин такої відсутності стандартизації було різноманіття методів збору даних про дихання, які мають прямий вплив на хімічне різноманіття, що виникає в будь-якому зразку видихуваного повітря. Видих Atem містить широкий спектр летких органічних сполук у дуже різних концентраціях 6. Отже, зміна методів обстеження змінює не лише кількість, але й різноманітність речовин, які можуть бути присутніми у зразку.

Відбір проб дихального газу напрочуд складний. Поки суб'єкти перед аналізом повинні видихати у мундштук колектора або в газонепроникний контейнер, відбір проб дихання повинен враховувати та враховувати ряд можливих змінних. У цій роботі ми продемонструємо конкретний, перевірений протокол газовиділення у дітей. На сьогоднішній день ми успішно впровадили цей протокол із гарячковими дітьми у віці 4 років, за польовим сценарієм в умовах обмеженого ресурсу (Малаві), сонячної теплової енергії під час обстеження дихання та аналізу трубопроводів для виявлення біомаркерів- 9. Потім ми також впровадили та оцінили наші протоколи для збору зразків дихання у дітей, що проходять обстеження, в сучасній допоміжній педіатричній клініці в США. Наші результати свідчать про те, що для ідентифікації біомаркерів дихання у дітей збір змішаного повітря є критичним, оскільки він забезпечує справжній «відбиток дихання» від даної людини. Крім того, змішаний вдих на видиху - це також найпростіший тип вдиху, якого можна досягти, оскільки всі фази видихуваного повітря (рот і ніс) набуваються 3.

У польових умовах, особливо коли пацієнти гостро хворі, може бути важко контролювати такі загальні незручності, як дієта, температура тіла та/або використання парфумів або кремів з певним предметом. Ці фактори можуть глибоко вплинути на обсяг та якість дихання. З цієї причини ми рекомендуємо дослідникам не тільки фіксувати час затримки дихання та доставки до сорбентних пробірок, але також враховувати інші специфічні для пацієнта фактори, такі як дієта (наприклад, 24-годинне відкликання дієти), використання рідини для полоскання рота та вживання ліків, спеціально оцінити ефекти цього потенційного сполучення під час відкриття біомаркерів та подальших аналізів.

Сполуки вдихуваного повітря також впливають на склад видихуваного повітря, що може стати проблемою для зусиль щодо виявлення біомаркерів. Таким чином, аналіз та реєстрація навколишнього повітря є важливим контролем, що дає важливі знання про походження летких речовин, що видихаються. Наприклад, леткі профілі навколишнього повітря використовувались для того, щоб визначити, чи є певне дихання летким при більшій чи меншій повноті дихання порівняно з навколишнім повітрям 11. Тому певна сполука для дихання вважається похідною всередині тіла (наприклад, ендогенного походження), якщо концентрація в диханні вища, ніж у повітрі, тоді як менша концентрація в диханні свідчить про те, що ця речовина отримана із навколишнього середовища (наприклад, екзогенне походження). Порівняння великої кількості летючого вмісту в диханні з повітрям у приміщенні також служить важливим позитивним контролем того, чи доцільний збір дихання. Як і в наших репрезентативних даних (рис.4) продемонстрували, що летюча сполука ізопрен має ендогенне походження і повинна бути присутнім у зразках дихання у концентраціях, що перевищують концентрацію повітря в навколишньому повітрі в 10 разів 6 .

Для виявлення біомаркерів нестабільні профілі людей із цікавими умовами необхідно порівнювати з відповідним здоровим контролем людей, щоб можна було ідентифікувати закономірності за допомогою статистичних методів, таких як машинне навчання та багатоваріантний аналіз. Описаний тут метод збору дихання може застосовуватися до різних патологічних станів; єдина вимога полягає в тому, щоб дитина добровільно взяла пробу для дихання. Оскільки тестування на дихання є неінвазивним, легко повторюється і відповідає артеріальним концентраціям біологічних речовин, воно має великі перспективи для впровадження в тестування для клінічного використання.

Майбутня робота буде зосереджена на розробці нових методів збору дихання у маленьких дітей та дітей (передплата необхідна. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори нічого не розкрили.

Подяка

Ми дякуємо дітям та сім'ям дитячої лікарні Сент-Луїса, які брали участь у цьому дослідженні. Ми визнаємо унікальні зусилля пані Стейсі Постма та пані Джанет Соколіч під час збору дихання. Ця робота підтримується Фондом дитячої лікарні Сент-Луїса.

---