Луїджі НАЛДІНІ

Луїджі Налдіні

Генна терапія гемопоетичних стовбурових клітин (HSC GT) стає потужною та універсальною стратегією лікування все більшої кількості захворювань людини. Гемопоетичні стовбурові/клітини-попередники (HSPC) збирають з організму, генетично інженерізуються ex vivo і повторно вливають тій самій особі після введення кондиціонуючої терапії, яка сприяє їх приживленню в кістковому мозку. Вбудований HSPC забезпечує постійне надходження генетично інженерних нащадків, потенційно на все життя реципієнта. Тоді зрілі клітини різних ліній можуть змінити такі патологічні стани, як успадкована імунна недостатність, порушення крові та зберігання, інфекції та рак (рисунок 1).

Від раннього тестування генної терапії HSC до розвитку лентівірусних векторів

У той час як HSC GT був одним із найбільш ранніх і найдовших пошуків застосування генної терапії, його клінічний розвиток пройшов довгий і нерівний шлях, ймовірно, визначаючи краще, ніж будь-який інший, курс усього поля генної терапії. HSC GT розпочав свою діяльність із передчасними та надмірно роздутими очікуваннями, незабаром зіткнувся з несподіваними перешкодами та токсичністю, що порушили її курс, і лише нещодавно досяг поліпшених та успішних клінічних результатів у зростаючій кількості захворювань завдяки вдосконаленому поколінню засобів (Dunbar et al, 2018; Naldini, 2011; Налдіні, 2015).

Для досягнення цих цілей ми зробили внесок протягом останніх 25 років у розробку нової системи передачі генів на основі людського лентівірусу ВІЛ, яка стала широко використовуватися в біомедичних дослідженнях (Naldini et al, 1996; Naldini et al, 2016). Ці лентивірусні вектори (LV) використовують основний механізм ВІЛ для ефективної транслокації ядер та інтеграції їх генетичного корисного навантаження в хроматин людських клітин, і вони упаковані з поверхневою оболонкою інших вірусів, що дозволяє орієнтуватись на широкий спектр клітин. Розвиток переносників протягом багатьох років позбавляв їх компонентів ВІЛ, що сприяли патогенезу, але були необхідними для передачі генів (Dull et al, 1998; Zufferey et al, 1998), і підтверджували їх безпеку та ефективність у кількох експериментальних аналізах та моделях захворювань. Було показано, що ЛШ, порівняно з γ-ретровірусними векторами, не лише забезпечує більш високу ефективність передачі генів, але й значно знижує ризик генотоксичності, завдяки вдосконаленому дизайну векторів та структурі інтеграції ВІЛ у клітинному геномі, що полегшує ризик появи вставних речовин, що активують онкоген (Biffi et al, 2011; Modlich et al, 2009; Montini et al, 2009; Wang et al, 2009; Zhou et al, 2010).

Уроки поточних випробувань HSC GT

З нетерпінням: перспективний розвиток генної терапії HSC

HSC GT в кінцевому підсумку може перевершити алогенний HSCT через нижчу коротко- та довгострокову захворюваність, пов’язану з лікуванням, а в деяких випадках і покращену ефективність (Sessa et al, 2016; Thrasher & Williams, 2017; Touzot et al, 2015). Оскільки HSC GT експлуатує аутологічні клітини, він практично доступний кожному пацієнту, зменшує ризик трансплантації проти хвороба-хазяїн, і йому не потрібно долати імунологічні бар'єри у реципієнта (за винятком, у деяких випадках, щодо терапевтичного генного продукту), тим самим щадячи потребу у пригніченні імунітету у реципієнта.

Автологічне налаштування також дозволяє вивчити цілий ряд кондиціонерів із зниженою інтенсивністю. Ці маневри дозволяють зменшити захворюваність на процедуру порівняно зі стандартним алогенним HSCT через швидше відновлення імунної системи, хоча ця перевага часто протиставляється впливу культури ex vivo та трансдукції на приживлення HSPC (див. Нижче). Ми тільки починаємо фіксувати всі переваги HSC GT в клініці, також враховуючи, що більшість стратегій лікування формуються в контексті невідповідності імунітету між донором та реципієнтом і, можливо, потребують коригування для кращого володіння аутологічною обстановкою. Можуть бути випробувані нові виснажувальні препарати, які краще націлюються на гемопоетичних родоначальників, зберігаючи стромальні компоненти кісткового мозку. Ці стратегії можуть дозволити швидко встановити достатній химеризм модифікованих родоначальників, не піддаючи пацієнта ризику нейтрофільної та/або лімфоїдної цитопенії/аплазії. У разі успіху ці досягнення можуть зменшити час та потребу в госпіталізації та врешті-решт перетворити HSC GT на амбулаторне лікування.

Вирішальні виклики та подальші цілі

У той час як клінічне розгортання HSC GT на основі LV було стабільно безпечним, ступінь переносу генів у повторно заселений HSC, а також пропорція та час встановлення трансплантованого клітинного трансплантата іноді були обмежувальними та дуже різними серед досліджень і навіть пацієнтів, які отримували лікування в той самий протокол, висвітлюючи вплив змінних, які в даний час уникнути нашого розуміння або контролю. Наприклад, у поточних випробуваннях HSC GT на β-таласемію та серповидно-клітинну хворобу обмежена швидкість трансдукції була визначена основною перешкодою для досягнення стабільних та надійних терапевтичних переваг, тобто незалежності від переливання крові, у більшості лікуваних пацієнтів (Thompson et al, 2018).

Іншим набором змінних, що впливають на трансплантований клітинний трансплантат, є введена доза репопуляційних клітин та ступінь клітинного виснаження, досягнутий у кістковому мозку за допомогою режиму кондиціонування, фармакокінетика та фармакодинаміка якого може відрізнятися у окремих пацієнтів. Джерело HSPC з мобілізованою периферичною кров’ю зараз віддають перевагу кістковому мозку, і протокол мобілізації впливає на загальну кількість та частку довготривалого повторного заселення проти здійснили клітини-попередники у врожаї. Поточні зусилля щодо збільшення виходу трансдукованих клітин, включаючи більш ефективні режими мобілізації та збору, використовуючи антагоністи осі CXCL12/CXCR4, такі як Plerixafor (Broxmeyer et al, 2005), та осі VLA-4/VCAM-1 (Ghobadi та ін., 2018), які опосередковують самонаведення та утримання HSPC в ніші кісткового мозку та/або стимулюючий колоній-гранулоцитарний фактор (G-CSF) та агоністи CXCR2, такі як GROβ, діючи на нейтрофіли та приводячи до секреції MMP-9, матрикс травлення та вивільнення HSPC (Hoggatt et al, 2018) та розширення зібраного HSPC ex vivo (див. нижче).

Багато захворювань впливають на HSPC та їх нішу кісткового мозку. Наприклад, HSC може накопичувати пошкодження ДНК або реплікаційний стрес через надмірний попит, викликаний хронічною інфекцією, відсутністю або дисфункцією окремих ліній, підвищуючи сприйнятливість до культури ex vivo та перенесення генів, а також зменшуючи здатність до приживлення (Flach et al, 2014) . Ті самі та інші умови можуть також змінювати склад популяції кісткового мозку, відносну частку та прихильність лінії різних родоначальників. Негемопоетичні компоненти ніші кісткового мозку також можуть уражатися хворобою безпосередньо або шляхом перехресних переговорів із зміненими гемопоетичними популяціями та забезпечувати менш сприятливе середовище для приживлення та відновлення за допомогою модифікованого геном HSPC, введеного в інфузію. Таким чином, розгортання HSC GT повинно бути належним чином відрегульовано, коли здоров'я кісткового мозку порушено хворобою, наприклад, шляхом попереднього лікування основного захворювання (тобто полегшення зберігання при порушеннях зберігання лізосом за допомогою замісної ферментної терапії, перевантаження заліза та розширення еритроїдної лінії гемоглобінопатій)., запалення при імунодефіцитах).

Нам все ще бракує надійних предикторів результату лікування при введенні HSC GT, оскільки вміст HSPC та кількість копій векторних копій на геном клітини (VCN; показник ступеня трансдукції) у клітинному продукті часто, але не завжди позитивно корелюють із ступенем та тривалість трансдукованого клітинного трансплантата. Це, ймовірно, тому, що лише хвилинна частка HSC серед культивованих клітин сприяє трансплантації, причому різні підмножини клітин сприяють ранньому проти. пізня фаза трансплантата. Ці рідкісні підмножини клітин можуть по-різному реагувати на умови культури та перенесення генів, і їх реакцію може бути важко прочитати через незрозумілий ефект надлишку подальших попередників та диференціюючих клітин, що ростуть у культурі. Оскільки ми краще характеризуємо поверхневі маркери HSPC у культурі, ми могли б розглянути можливість оцінки VCN у перспективно визначеній підгрупі прищеплення HSC у продукті за умови, що використовувані маркери не змінюються культурою ex vivo.

Генетична модифікація, будь то шляхом опосередкованого переносом генів або опосередкованого нуклеазою редагування генів (див. Нижче), може викликати внутрішньоклітинні реакції в HSPC, що впливають на проліферацію, диференціацію та загальну придатність, тимчасово чи довгостроково (Piras et al, 2017; Rossetti et al, al, 2011). Такі відповіді залежать від датчиків у цитоплазмі та ядрі екзогенних нуклеїнових кислот, а також розривів ДНК, фрагментів та вільних кінців, що може викликати відповідь на пошкодження ДНК (DDR) (Ciccia & Elledge, 2010) з активацією p53 -залежна зупинка клітинного циклу, старіння або апоптоз, а також відповідь інтерферону з подальшою активацією HSPC та прихильністю мієлоїдів, що може вичерпати довгостроковий потенціал репопуляції (Beerman et al, 2014). Удосконалення генно-інженерних технологій для запобігання або протидії зондуванню нуклеїнової кислоти та подальших реакцій може бути важливим для забезпечення довгострокового відновлення кровотворення реципієнта за допомогою генно-інженерного HSC.

Інший шлях до кращого дизайну векторів стосується підвищення жорсткості контролю експресії трансгену для кращого відтворення ендогенного зразка експресії заміщеного гена та різкого націлювання на бажану лінію клітин. Ці цілі виконуються з використанням послідовностей контролю транскрипції, отриманих з ураженого ендогенного гена, та шляхом включення послідовностей-мішеней мікроРНК у транскрипт трансгену, які запобігають його ектопічну або аберрантну експресію у нецільових клітинних типах, що експресують споріднену мікроРНК (Brown et al, 2007; Gentner et al, 2010).

Нарешті, навіть в умовах аутологічного HSC GT ми повинні усвідомлювати потенційну появу імунної відповіді на терапевтичний генний продукт, який може діяти як чужорідний антиген у реципієнта, і на трансдуковані клітини, які можуть тимчасово експресувати після вектора трансдукції. похідні компоненти, такі як алогенні молекули HLA, вбудовані у віріони при відтокуванні від плазматичної мембрани клітини продуцента ЛШ людини (Milani et al, 2017). Хоча про виникнення таких імунних ускладнень ще не повідомлялося в клінічних випробуваннях, ми повинні уважно стежити за ними, оскільки застосування HSC GT поширюється на нові захворювання та використовує більш м'які режими кондиціонування, де імунну відповідь може бути легше зустріти. Якби такі реакції спостерігалися і мали згубний вплив на приживлення HSC, можна було б використати цілий ряд стратегій придушення імунітету, чи широко діючих, чи специфічних для трансгенів, щоб подолати їх і забезпечити взяття та підтримку трансплантата.

Точна генна інженерія: цільове редагування генів

Дизайнерські ендонуклеази ДНК, націлені на передбачувану послідовність, можуть бути сформовані за допомогою декількох платформ, які складаються з модулів розпізнавання ДНК, специфічних для послідовності, поєднаних з доменами ендонуклеази. Платформи цинкового пальця, TALEN та мегануклеази використовують димерне або мономерне розпізнавання послідовностей ДНК на основі білка, щоб прив’язати ендонуклеазу до цільової ДНК, тоді як нещодавно розроблені системи CRISPR/Cas використовують розпізнавання послідовностей на основі РНК, пов’язане з активацією ендонуклеолітичної активності білка. (Doudna & Charpentier, 2014). Поточні дані підтверджують твердження, що всі платформи можуть бути оптимізовані для досягнення надійного і високоспецифічного розщеплення передбачуваної ДНК-мішені з обмеженою активністю цільової активності. Враховуючи широкий вибір платформ і постійно виникаючі варіанти з новими або розширеними властивостями розпізнавання цільової послідовності, покращеною активністю та специфічністю, можна припустити, що практично кожна послідовність, унікально зустрічається в геномі, може бути ефективно і конкретно націлена (Tsai & Joung, 2016; Урнов, 2018).

Вихід на ринок

Жодна з вищезазначених обіцянок HSC GT не могла бути реалізована або стати доступною для пацієнтів у всьому світі без участі фармацевтичної промисловості та процесів розробки, реєстрації та комерціалізації ліків. Незважаючи на те, що покладався на ранню конструкцію γ-ретровірусних векторів, HSC GT для одного типу ПІД, важкого комбінованого імунодефіциту аденозину дезамінази (ADA-SCID), унікально і послідовно довів, що є безпечним і став першим препаратом ex vivo GT, який зараз доступний в ЄС ринку (Aiuti et al, 2017). Це важливе досягнення доводить, що проблеми, пов'язані з комерційним впровадженням персоналізованих методів лікування, що передбачають складну обробку аутологічних клітин ex vivo, можуть бути успішно вирішені навіть в умовах рідкісних захворювань, коли є дані про сильну користь для пацієнтів. Очікується, що кілька згаданих вище HSC GT на основі НН вийдуть на ринок за один або кілька років вперед. Наш ранній досвід у цій галузі свідчить про те, що найбільш сприятливим шляхом до подальшого клінічного розвитку та доступу до ринку HSC GT є ранній союз між академічними установами, які стали першопрохідцями клінічних випробувань, та фармацевтичними компаніями.

На закінчення ми перебуваємо на світанку нової ери в медицині, коли багато видів лікування, таких як HSC GT, обговорювані тут, кидають виклик традиційним рамкам розробки лікарських засобів і вимагають креативних рішень для забезпечення стійкої комерціалізації та справедливого доступу громадськості, але також пропонують винагороду драматичних терапевтичних переваг. Тільки нещодавно налагоджена співпраця між усіма зацікавленими сторонами в галузі науки, медицини, фармацевтичної промисловості, адвокаційних груп, регуляторних органів та органів, що приймають рішення в різних країнах, заснована на наукових доказах та натхненна етичними принципами справедливого суспільства, дозволить вирішити ці виклики та зрозуміти обіцянка забезпечити довгоочікуване полегшення частини невдоволеного тягаря нашої людської братії.

Фігура 1

ГСН-генна терапія

Список літератури:

Вчитель. Доктор Луїджі Налдіні

Інститут генної терапії Сан-Раффаеле-Телетон (SR-TIGET)
Via Olgettina 58
20132 Мілан
Італія