Мітохондріальні цитопатії - PDF скачати безкоштовно

Мітохондріальні цитопатії Обробка різних патогенезів вибраних мітохондріальних цитопатій на основі двох тематичних досліджень Крістіана Гаверкампа

цитопатії

Мітохондріальні цитопатії Обробка різних патогенезів виділених мітохондріальних цитопатій на основі двох тематичних досліджень Дисертація, затверджена медичним факультетом Рейнського університету в Аахені для здобуття вченого ступеня доктора медицини, поданого Ларсом Крістіаном Арндтом Саймоном Хаверкартпросом з Дюсбургського університету Реверпромп вип. нац. Герхард Бусе Містер професор університету доктор мед. J. Michael Schröder День усного іспиту: 13 червня 2008 р. Ця дисертація доступна в Інтернеті на веб-сайті університетської бібліотеки

Зміст 1 Вступ. 4 1.1 Мітохондрії. 4 1.1.1 Окисне фосфорилювання (OXPHOS). 4 1.1.2 Реакційні форми кисню. 5 1.1.3 Апоптоз. 5 1.2 Будова та організація мітохондріальної ДНК (mtdna). 6 1.3 Первинні мітохондропатії. 8 1.3.1 Точкові мутації mtdna. 8 1.3.2 Видалення mtdna. 11 1.4 Вторинні мітохондропатії. 11 1.5 Первинна кардіоміопатія. 12 1.5.1 Дефекти ядерних генів. 12 1.5.2 Дефекти генів мітохондрій. 15 2 Мета роботи. 19 3 Матеріал та методи. 20 3.1 Походження зразків тканин. 20 3.1.1 Елементи керування. 20 3.1.2 Пацієнт p1/p2. 20 3.1.3 Пацієнт p3. 21 3.1.4 Пацієнт p4. 21 3.2 Підготовка мітохондріальної ДНК. 25 3.2.1 Виділення mtdna з крові. 25 3.2.2 Виділення mtdna з м’язової тканини. 26 3.2.3 Органічний лізис. 27 3.2.4 Екстракція фенолом/хлороформом. 27 3.3 Гель-електрофорез. 27

3.3.1 Електрофорез в агарозному гелі. 27 3.3.2 Електрофорез в акриламідному гелі. 28 3.4 ПЛР. 30 3.4.1 Звичайна ПЛР. 30 3.4.2 Міжміські -PCR (LPCR). 32 3.5 Послідовність. 33 3.5.1 Очищення ДНК. 34 3.5.2 Реакція секвенування. 34 3.5.3 Підготовка зразків до автоматичного вимірювання. 34 3.5.4 Оцінка вимірювання. 35 3.6 Поліморфізм довжини фрагмента обмеження (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 MELAS: Apa-1 A3243G. 35 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Рішення та буфери. 37 4 результати. 40 4.1 LHON. 40 4.1.1 Підготовка. 40 4.1.2 ПЛР. 4.1.3 Аналіз обмежень. 40 4.2 Кардіоміопатії. 42 4.2.1 Підготовка мікром'язів. 42 4.2.2 Підготовка. 43 4.2.3 Скринінг видалення LPCR. 43 4.2.4 Послідовність. 45 5 Обговорення. 47 5.1 LHON. 47

5.1.1 Патогенез. 47 5.1.2 Цитостатична терапія. 51 5.1.3 Література та підсумкове оцінювання. 54 5.2 Кардіоміопатія. 56 5.2.1 Міжгеномне спілкування. 56 5.2.2 Значимість знайдених змін. 65 5.2.3 Резюме. 67 6 Довідники. 69 6.1 Список таблиць. 69 6.2 Список малюнків. 69 6.3 Список скорочень. 70 6.4 Бібліографія. 73

1.1 Мітохондрії Конденсація хроматину та розпад хроматину, в яких також бере участь САПР. Відкриття перехідної пори мітохондріальної проникності (mtptp) призводить до колапсу електрохімічного градієнта, набухання внутрішньої мембрани та розриву зовнішньої мембрани. Здається, mtptp складається з транслокатора нуклеотидного андезинозину (ANT), порину та інших факторів, таких як Bax (асоційований з BCL2 білок X), Bcl2 (b-клітинний лейкоз/лімфома 2), циклофілін D та рецептор бензодіазепіну. Відкриття, ймовірно, спричинене підвищеним впливом АФК, падінням Ψ або надмірним споживанням кальцію. 2-9 Рисунок 1: Важливі метаболічні шляхи в мітохондрії 1.2 Структура та організація мітохондріальної ДНК (mtdna) Мітохондрії знаходяться під контролем двох геномів. Більшість мітохондріальних структурних і функціональних білків кодуються ядром, перекладаються в цитозолі і транспортуються в мітохондрію за допомогою послідовності розпізнавання. 13 білкових субодиниць, 22 трна і 2 рна кодуються геном мітохондрій. Білки є лише частиною дихального ланцюга: цитохром b, субодиниці 1, 2 і 3 цитохрому с оксидази, 6-й

1.2 Структура та організація мітохондріальної ДНК (mtdna) Рисунок 2: Геном мітохондрій та характерні мутації 1.3 Первинні мітохондропатії 1.3.1 Точкові мутації mtdna 1.3.1.1 Спадкова оптична нейропатія Лебера (LHON) LHON гостро призводить до підгострої сліпоти через центральну втрату поля зору. В основному страждають чоловіки середнього віку. В даний час відомо 18 мутацій мітохондріальної ДНК, які викликають захворювання окремо або в поєднанні. 1.3.1.1.1 Клінічні особливості Симптоми зазвичай починаються в середині життя з гострою до підгострої безболісної втрати центрального поля зору. Фундоскопічно, 8

3,6 г тканини, яка розділена на порції приблизно по 100 мг. Потім ця порція обробляється як мікропрепарат 26, людина

3.2 Підготовка мітохондріальної ДНК Гранули мітохондрій об’єднуються. Максимальна підготовка використовується для отримання шаблонів управління. Матеріал пацієнта на замовлення

3.4 ПЛР прямого та зворотного праймерів (MWG Biotech) та 1350 мкл стерильного Aqua. Умови ПЛР для окремих фрагментів наведені в таблицях 5 та 6. Для відповідних фрагментів умови ПЛР відрізняються за температурою відпалу, часу продовження та кількості циклів. Температура за Цельсієм Час у секундах Перша денатурація 94 300 Денатурація 94 30 Відпал Танна 60 Розширення 72 Текстова таблиця 5: Основний профіль ПЛР 31

3.6 Поліморфізм довжини фрагмента обмеження (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G Мутація LEIGH T8993C та T8993G виявляється за допомогою RFLP-аналізу фрагмента 7. Схема рестрикції Msp-I (Gibco BRL) з місцем розщеплення C ^ CGG для цього фрагмента показана на фіг. MELAS: A3243G дикого типу MERRF: A8344G мутація дикого типу 3001 Leigh: T8993C/G мутація дикого типу 7415 мутація 8363 246bp 3247 1431bp 839bp 839bp 629/630bp 842bp 1185bp 41bp 8254 41b 8p2 9205 Рисунок 3: Схематичне зображення схеми обмеження 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Для аналізу RFLP мутації LHON 11778 доступні два різні тести. Мутація LHON призводить до елімінації одного місця розщеплення при обмеженні F10 за допомогою SfaN-I та нового місця розщеплення у випадку обмеження Mae III. Використання обох методів тестування зменшує ризик помилково негативного або хибнопозитивного результату. 36

3.6 Поліморфізм довжини фрагмента обмеження (RFLP) Обмеження SfaN I: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 Дикий тип Рисунок 4: Шаблон обмеження LHON 11778 з обмеженням SfaN I Mae III: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 20070 LHON 255 58 Дикий тип Малюнок 5: Шаблон обмеження LHON 11778 з розчинами MAE III 3.7 та буфером Фрагмент-специфічна основна суміш (ПЛР) 5,55% прямий праймер (8 пмоль/100 мкл) 5,55% зворотний праймер (8 пмоль/100 мкл) 1,11% полімеризації -Змішайте 11,11% 10-кратний буфер Taq 76,66% аква-стерильний буфер гемолізу 37

3.7 Розчини та буфери 10 мм NH4HCO3 144 мм NH4Cl H буфер 210 мм маніт 70 мм сахароза 1 мм EDTA 5 мм HEPES (1M розчин) 0,5% буфер для завантаження альбуміну (агарозні гелі) 15% Ficoll 50 мм EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (мас./Мас.) Бромофеноловий синій 0,1% (мас./Мас.) Буфер завантаження ксилолового ціанолу (поліакриламідні гелі) 98% деіонізований формамід 10 мМ ЕДТА, рН 8,0 0,025% бромофенол синій 0,025% ксилол ціанол сахарозний буфер 250 мМ сахароза

3.7 Розчини та буфери 10 мМ TrisCl рН 7,4 1 мМ ЕДТА розчин SDS (0,1%) 0,1% SDS 1 мМ ЕДТА 10xTBE ​​1М Трис-HCl 0,83 М борна кислота 10 мМ ЕДТА з регульованим значенням рН 8,3 TE буфер 10 мм TrisCl, рН 8,0 1 мм EDTA 39

4.1 LHON Це нове місце розщеплення спричинене мутацією LHON у положенні 11778. Немає залишків смуги дикого типу (255 п.н.). L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp і 130 bp Рисунок 6: Агарозний гель для розділення фрагментів рестрикції Mae III. Мати пацієнта p2 також несе мутацію, гомоплазматичну в обох клітинних рядах. На фіг.7 показано перетравлення фрагмента 10 (препарат лейкоцитів) ферментом рестрикції SfaN1. Елемент управління (K) показує 3 смуги (679 bp, 318 bp і 122 bp). У досліджуваному фрагменті 10 (р2) місце розщеплення в положенні 11778 опущено; смуги 679 bp та 318 bp відсутні. Натомість виникає смуга 997 bp. Цей результат узгоджується з перетравленням Mae-III, не показаним тут. 41