Оцінка мікросудинної функції жирової тканини людини за допомогою протоколу відеомікроскопії

Резюме

Системи відеомікроскопії використовуються для вивчення функціональних властивостей ізольованих артеріол жирової тканини у відповідь на фізіологічні та фармакологічні подразники. Ця методика може бути використана для вивчення мікросудинних фенотипів у різних доменах жирової тканини у людей із ожирінням.

Анотація

Вступ

Наша лабораторія застосовує відеомікроскопію для вивчення взаємозв’язку між ожирінням та судинною дисфункцією, з акцентом на вплив різних доменів жирової тканини на судинну систему. Центральне ожиріння з накопиченням внутрішньочеревного вісцерального жиру, швидше за все, пов’язане з виробленням адипоцитокінів, порушеннями обміну речовин та ризиком кардіометаболізму. Існує постулат, що дисфункція жирової тканини із надпродукцією проатерогенних цитокінів та порушенням регуляції адипокіну значною мірою бере участь у цих процесах, але певні регуляторні молекули та цілі лікування в основному залишаються невизначеними. 4 До речі, на рівні місцевої жирової тканини розрідження капілярів та порушення кровотоку пов’язані з псевдогіпоксією жирової тканини та порушенням регуляції метаболізму. Гіпотеза про те, що серцево-судинні захворювання розвиваються, можливо, наслідком дисфункції жирової тканини. Проатерогенні медіатори з жиру, особливо ті, що пов’язані із середнім/вісцеральним ожирінням, можуть сприяти дисфункції ендотелію та патогенним збудникам судинних змін, які можуть проявлятися локально в жировій судинці та виявляти, використовуючи методику, описану тут. 5

Функціональна оцінка ізольованих артеріол жирової тканини є корисним підходом до розуміння патофізіології та молекулярних механізмів, що сприяють порушенням функції судин при ожирінні людини. Для дослідження механізмів, що сприяють специфічній дисфункції жирового депо, ми використовували методи для тестування ендотеліозалежних та незалежних судинорозширювальних реакцій з боку мікросудин та оцінювали експресію різних кандидатів на регуляцію у зв’язаних зразках жирової тканини вісцеральної та підшкірної (SC) жирової тканини. Ожирілі суб’єкти на момент отримання баріатричної хірургії.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Протокол та приклади, описані тут, були схвалені Інституційною комісією з огляду медичної школи Бостонського університету (IRB, Протокол № H-25644) та складені відповідно до Гельсінської декларації. Усі суб’єкти надали письмову згоду до участі.

1. Приготуйте розчини та мікроскляні канюлі

2. Підготувати реактиви

  1. приготувати ацетилхолін (ах, 10 -2 М, маточний розчин). Розчиніть 18,29 г у 10 мл деіонізованої води. Збережіть 1 мл аликвоти вихідного розчину (10 -2 М) при -80 ° C. Послідовно розбавляйте в день експерименту, щоб отримати наступні робочі концентрації: 10 -5, 10 -9, 10 -6, 10 -7, 10 -8 вул.
  2. Приготуйте папаверин (2 х 10 -2 М, основний розчин). Розчиніть 0,07517 г у 10 мл деіонізованої води. Приготуйте 10 мкл аликвот вихідного розчину і послідовно розбавляйте при -80 ° C, щоб отримати 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 М в день експерименту.
  3. Приготувати ендотелін-1 (ЕТ-1, 2 х 10 -5 М, основний розчин). Розчиніть 50 мкг ендотеліну-1 в 1 мл 1% BSA/PBS. Збережіть 1 мл аликвоти вихідного розчину (2 х 10 -5 М) при -80 ° С. Розведіть у день експерименту, щоб отримати робочу концентрацію 10 -10 М у день експерименту.
  4. Зберігайте реагенти при -20 ° C або до -80 ° C залежно від типу морозильної камери, але не довше 6 місяців.

3. Збір жирової тканини та підготовка судин

4. Оцінка мікросудинної функції ожиріння

Примітка: загалом жировий артеріолярний ендотелій-залежний розширення судин може бути викликаний у відповідь на фізіологічний (індукований потоком) та фармакологічний подразники (індукований Ах).

  1. Опосередкована потоком, ендотелійзалежна вазодилатація
    1. після тиску запишіть діаметр жирової артеріоли в спокої (Di). Це називається діаметром базової лінії спокою.
    2. Попередньо кровоносні судини стискаються,

    55% вихідного діаметра спокою (Dp), додаючи 1 мкл ендотеліну-1 (ET-1, 10-10 М) безпосередньо у ванну і чекаючи 5 хв. Повторюйте цей процес, поки не досягнете бажаного

    5. Аналіз та обчислення даних

    1. розрахувати реактивність судин. Використовуйте відсоток розширення судин для роздруківки даних, враховуйте базові відмінності в діаметрі судини та обчислюйте, використовуючи таке рівняння:
      % Розширення судин (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      де DT - записаний діаметр в даний момент часу (максимальний діаметр), Dp - діаметр, записаний після додавання судинозвужувального агента (тобто ЕТ-1 викликав звуження діаметра), а Di - діаметр, який був безпосередньо перед додаванням судинозвужувального агента (діаметр базової лінії спокою) зафіксовано. 9
    2. Визначте вазодилатаційну та вазоконстрикційну чутливість (реакція на дозу) на агоніст як концентрацію Ах, Папаверину або ЕТ-1, яка викликає 50% максимальної відповіді (ЕГ 50), визначеної сигмоподібним параметром і побудованої, як описано раніше. 10
      ПРИМІТКА: дослідження відтворюваності вазодилатації жирових мікросудин між спостерігачами мають високий коефіцієнт кореляції (CC) 0,99 (n = 10 експериментів Шиффа) у нашій лабораторії.

    1. Виражайте безперервні вимірювання, оскільки ± SEM означає, що вони мають тенденцію до нормального розподілу. Проаналізуйте реактивність судин в жирових артеріолах шляхом багатосторонньої дії ANOVA.
    2. В якості альтернативи порівняйте площу під кривою (AUC) дії кумулятивного розширення судин з реакцією на дозу між групами лікування. У всіх випадках враховуйте необхідність підписки на P. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Наша лабораторія використовувала відеомікроскопію для дослідження ендотеліозалежної та незалежної вазодилатації, а також судинозвужувальної функції жирової тканини, ізольованих артеріол з підшкірної та вісцеральної жирової тканини у людей, що страждають ожирінням. Характерна експериментальна установка показана на малюнку 1Авідображається. Артеріоли жирової тканини підвішені між двома капілярними скляними піпетками і закріплені швами в органній камері, як на малюнку 1bпоказано. Як описано вище в розділі 5.1, артеріолярні реакції можна оцінити, досліджуючи судину на вихідному рівні (рис. 2А) з подальшим попереднім звуженням за допомогою ET-1

    55% від діаметра базової лінії (рис. 2 b), а потім індуковані агоністами вазодилатація та розслаблення просвіту судин, як на малюнку 2показано.

    тканини
    Рисунок 1: Структура відеомікроскопії. (А.) Зображення, що зображує компоненти камери органу відеомікроскопії. (B.) Зображення артеріоли жирової тканини людини, встановленої між двома скляними капілярними піпетками в камері органу. Діаметр Шиффа змінюється у відповідь на фізіологічні та фармакологічні подразники, які можна дослідити та визначити кількісно за допомогою програмного забезпечення для аналізу та інвертованого кріплення камери, що спеціалізується на системі. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

    мікросудинної
    Рисунок 2: Візуалізація мікросудинної вазодилатації за допомогою відеомікроскопії під тиском. (А.) вихідний діаметр артеріол у спокої (діаметр після тиску, відсутність агоніста або стимуляції: вівторок) (B.) вже звужені діаметри (індуковані звужені діаметри після ET-1: Dp), (C.) Індуковане агоністами зменшення діаметра (після додавання Ах: DT). Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

    оцінка
    Рисунок 3: Залежне від ендотелію та незалежне розширення судин у підшкірній та вісцеральній артеріолах жирової тканини у людей із зайвою вагою. Залежне від ендотелію розширення судин значно зменшилось у вісцеральних відділах порівняно з підшкірними жировими артеріолами шляхом (А.) Оцінка збільшення потоку (парні підшкірні та вісцеральні судини, n = 20), або (B.) Відповідь на дозу ацетилхоліну з/без L-NAME (парні підшкірні та вісцеральні судини, n = 16). (C.) Незалежно від ендотелію вазодилатація не змінювалась диференціально між вісцеральною та підшкірною артеріолами, коли оцінювали реакцію на дозу папаверину (парні підшкірні та вісцеральні судини, n = 8). * Позначає групові відмінності між складами; † Позначає депо-специфічні відмінності між ацетилхоліном та L-NAME порівняно з окремим ацетилхоліном; НС: не суттєво. Дані представлені у середньому ± SEM, p Необхідна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Розсічення та ізоляція ожирілих артеріол з навколишніх тканин може бути трудомістким процесом із пильною увагою до деталей та технічного протоколу. Процедура мікродисекції вимагає ретельних навичок та спеціалізованої дисекційної атрибутики, щоб уникнути можливого пошкодження гладких м’язів або ендотеліальних шарів клітини мікросудин. Навіть найменший випадковий прокол стінки артеріоли може запобігти внутрішньосвітлевому тиску і призводить до невдалої спроби. Крім того, канюлювання артеріол швами має вирішальне значення для закріплення артеріол між скляними капілярними кінчиками піпетки на кожному кінці посудини.

    Ізолюючі мікросудини людини можуть розвинути спонтанний міогенний тон після 30-40 хв тиску при 60 мм рт. Ст. Однак ми виявили, що жирові артеріоли людини, розмір яких зазвичай становить 50-350 мкм внутрішнього просвіту, є відносно малими з рідкісними шарами гладком'язових клітин судин і не мають тенденції до розвитку значного міогенного тонусу порівняно з артеріолами скелетних м'язів. Таким чином, ми запускаємо попереднє звуження цих малих артеріол за допомогою ЕТ-1 перед впливом судинорозширювальних засобів. Ми виявили, що ЕТ-1 надає більш надійну судинозвужувальну реакцію, тоді як у деяких випадках можливі мінливі реакції на агоністи альфа-рецепторів, такі як фенілефрин. Обов’язково використовувати відповідний агоніст для індукування бажаного

    55% попереднього вирізу на вибір; Однак важливо також вибрати правильну кількість попередньо звужуючого агента над дозуванням, щоб запобігти токсичному пошкодженню судини. Для цього ми починаємо з нижнього ряду дози і титруємо, як описано в розділі 4.1.2.

    Артеріоли в жировій тканині чутливі до змін рН та температури; 14 Тому надзвичайно важливо контролювати та контролювати відповідний рН (7,4) та температуру (37 ° С) під час експериментальної процедури. Хоча відеомікроскопія є суворо контрольованою температурою, в експерименті необхідно контролювати рН розчину, щоб уникнути зсувів, які можуть призвести до перекосу результатів. Безперервне барботування розчину РАКУ та розчину заміни кожні 15 хвилин на етапах наддуву та промивання зменшить коливання рН з часом.

    Відеомікроскопія є корисною методикою для вивчення функціональних властивостей мікросудин, ця методика має значну криву навчання та потенційно трудомістку, особливо під час процесу судинної ізоляції. Залежно від типу тканини, яка підлягає біопсії, наш досвід мікроциркуляції жирової тканини показав, що процедура канюляції може зайняти значну кількість часу та терпіння. Крім того, властива тимчасова чутливість до експериментів, оскільки судини поза тілом з часом втрачають свої фізіологічні та функціональні властивості. Отже, експерименти повинні проводитися в життєздатних вікнах судин за хвилини до годин після хірургічної біопсії до будь-якого погіршення тканин.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автори не мають деталей та конфліктів інтересів, про які повідомляють.

    Подяка

    Автори висловлюють подяку волонтерам за участь у цих дослідженнях та працівникам операційної в Бостонському медичному центрі за надання біопсій жирової тканини. Лікар. Gökce підтримується грантами Національного інституту охорони здоров’я (NIH), HL081587, HL114675 та HL126141. Лікар. Колір залежить від гранту NIH K23 HL135394.