Пам’ять МАГІСТРА
ﺟﺎﻣﻌﺔ وھﺮان اﻟﺴﺎﻧﯿﺎ Університет Орана Ес-Сенія Факультет наук Відділ біології Лабораторія фізіології харчування та безпечності харчових продуктів ﻛﻠﯿﺔ اﻟﻌﻠﻮم ﻗﺴﻢ اﻟﺒﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺎ ﻣﺨﺒﺮ ﻓﺴﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺎ اﻟﺘﻐﺬﯾﺔ و اﻵﻣﻦ اﻟﻐﺬاﺋﻲ МАГІСТЕР Варіант дисертації: Фізіологія харчування та безпека харчових продуктів. Тема: Триптичний та хімотрипсичний гідроліз білків верблюжої сироватки. Вивчення антигенності/алергенності гідролізатів у мишей BALB/C. Представлено: Г-жо БЕНХАТЧІ Сухіла За підтримки: 2011 р. Перед членами журі: Президент: пан САІДІ Д. Професор, Оранський університет. Експерти: пан пан AOUES A.E.K. ЧЕКРУН А. Професор, професор, Оранський університет. Університет Орана. Доповідач: пан ХЕРУА О., професор, Університет Орана. Співдоповідач: пан MEZEMAZE F. Помічник Метр A, Оранський університет.
ПОСВІЩЕННЯ Я присвячую цю скромну роботу: Моєму покійному батьку, нехай добрий Бог прийме його серед його милосердя. Моя мати та мої свекрухи, які підтримували мене протягом моєї подорожі своїми благословеннями. Мій дорогий чоловік, якому я ніколи не буду вдячний за його доброту, терпіння, підтримку та щедрість. Мій обожнюваний син Реда, якому я бажаю життя, повного успіху та щастя. Моя сестра та мої 3 брати, допомога яких була ціннішою протягом усього мого навчання. Мої невістки: Хаєт-Нассіма-Гізлен-Аміна-Джалала та Бадра за всі добрі часи, які були дуже корисні для морального духу. Пане директору (Абдельхаді М), а також усім моїм колегам з установи Ain El Beida 3 за їх безцінну допомогу та втішне заохочення. Всім своїм родичам та друзям, у яких я завжди знаходив підбадьорення та повагу.
Список абревіатур та скорочень μa μm Ag AG AL (OH) 3 APLV Arg Asp Da DDP ELISA E/SG GALT Glycine His I IgE IgG Isc KDa L LC LB LD LSD LSV LV M MG Mn mv OPD ph PM SAB SDS T TCA TG Trp Trs/mn Спробуйте α-la β-lg: Мікроампер.: Мікромоль.: Антиген.: Жирна кислота.: Гідроксид алюмінію.: Алергія на білки коров’ячого молока.: Аргінін.: Аспарагінова кислота.: Далтон.: Різниця потенціалів.: Імуноферментний аналіз імуноферментного зв’язку.: Фермент/Субстрат.: Провідність.: Асоційовані з кишечником лімфоїдні тканини: Гліцин.: Гістидин.: Ізолейцин.: Імуноглобулін Е.: Імуноглобулін Г .: Струм короткого замикання.: KiloDalton.: Лейцин.: Козяче молоко.: Овече молоко.: Молоко Dromedary.: Молочна сироватка із дромедару.: Сироватка з коров’ячого молока.: Молоко Dromedary.: Метіонін.: Жир.: Хвилини.: Мілівольт.: Ортофенілен діамін.: Водневий потенціал.: Молекулярна маса.: Сироватка бичачого альбуміну.: Додецилсульфат натрію.: Температура.: Трихлороцтова кислота.: Тригліцериди.: Триптофан.: Обертів/хв.: Тирозин.: Альфа-лактальбумін.: Бета-лактоглобулін.
Рисунок 19: Вплив осадження β-Ig та гідролізатів сироватки коров’ячого молока на провідність G.56 Рисунок 20: Вплив осадження β-lg та гідролізатів сироватки дроммедару на провідність G 57 Рисунок 21: Вплив осадження α-la та гідролізатів сироватка з молока дромедару на Isc. 58 Рисунок 22: Вплив осадження α-la та гідролізатів сироватки коров’ячого молока на Isc. 59 Рисунок 23: Вплив осадження α-la та гідролізатів сироватки коров’ячого молока на DDP. 60 Рисунок 24: Вплив відкладення α-la та гідролізатів сироватки молочної сироватки двомедиарного типу на DDP. 61 Рисунок 25: Вплив осадження α-la та гідролізатів сироватки з верблюжого молока на провідність G. 62 Рисунок 26: Вплив осадження α-la та гідролізатів сироватки з коров’ячого молока на провідність G. 63
Список таблиць: Таблиця 1: Середній склад верблюжого молока за період між 1905 і 2009 рр. 11 Таблиця 2: Склад розчинів, що використовуються для визначення білків за методом Lowry et al.; 1951.25 Таблиця 3: Склад розчину нінгідрину. 27 Таблиця 4: Склад 12,5% гелів поліакриламіду додецилсульфату натрію. 29 Таблиця 5: Склад буфера зразків. 30 Таблиця 6: Склад міграційного розчину. Таблиця 7: Склад фарбувального розчину. 31 Таблиця 8: Склад відбілюючого розчину. 31 Таблиця 9: Склад солі, забуференного фосфатом PBS.37 Таблиця 10: Склад буферних розчинів ІФА 37 Таблиця 11: Склад розчину Рінгера.41
Короткий вступ. 1 Бібліографічні нагадування 1- Харчова алергія. 3 1-1 Визначення харчової алергії. 3 1-2 Механізм харчової алергії. 3 1-3 Усна толерантність. 3 1-4 Алергія на білки коров’ячого молока. 6 1-4-1 Алергени в коров’ячому молоці. 6 1-4-2 Перехресна алергія. 6 * Поперечна алергія, пов’язана з коров’ячим молоком. 6 1-4-3 Лікувальне лікування APLV. 7 2- Молоко Dromedary. 9 2-1 Властивість дромедарного молока. 9 2-1-1 Фізичний характер. 9 2-1-2 Хімічний склад. 10 2-1-2-1 Жир. 10 2-1-2-2 Білки верблюда. 10 * Казеїни. 10 * Білки сироватки. 12 2-1-2-3 Інші складові. 12 * Лактоза. 12 * Мінерали. 12 * Вітаміни. 12 2-2 Молочна мікрофлора молочного дроду. 13 2-3 Лікарське та терапевтичне використання дромедарного молока. 13 3- Травлення. 14 3-1 Перетравлення білків. 14 3-1-1 Внутрішньошлункове травлення. 14 3-1-2 Травлення підшлунковою залозою. 14 3-2 Екзокринна функція підшлункової залози. 14 3-2-1 Ферментативна секреція. 15 3-2-1-1 Ендопептидази. 17 3-2-1-1-1 Трипсин. 17 3-2-1-1-2 Спосіб дії трипсину. 17
3-2-1-1-3 Хімотрипсин. 20 3-2-1-1-4 Спосіб дії хімотрипсину. 20 Матеріали та методи 1-Приготування сироватки. 22 1-1 Скіммінг. 22 1-2 Отримання сироватки. 22 2- Біохімічна характеристика білків сироватки з двох молоків. 24 Принцип 2-1-1. 24 2-1-2 Дозування. 24 3- Протокол ферментативного перетравлення сироватки in vitro із дромедару та коров’ячого молока 3-1 Характеристика використовуваних ферментів. 24 3-2 Процедура складання протоколу. 26 4- Вимірювання ферментативного травлення in vitro. 26 4-1 Принцип. 26 4-2 Процес. 28 5- Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності SDS. 28 5-1 Принцип. 28 5-2 Режим роботи. 32 6- Тварини. 32 6-1 Розподіл тварин. 32 6-2 Імунізація тварин. 33 6-2-1 Вибір ад'юванта. 33 6-2-2 Збір крові. 33 6-3 Оцінка ступеня сенсибілізації тварин. 35 6-3-1 Принцип. 35 6-3-2 Процедура. 35 6-3-3 Вивчення реакційної здатності гідролізатів. 36 6-4 Вивчення алергенності гідролізатів сироватки з дромедару та коров’ячого молока. 6-4-1 Техніка дослідження in vitro в камері Уссінга. 38 6-4-1-1 Принцип. 38 6-4-1-2 Збір фрагментів тонкої кишки миші в камері Уссінга. 38 6-4-1-3 Експериментальна процедура. 40 7- Статистичні методи. 42
Результати 1-сироваткові білки в молоці. 43 2- Триптичний та хімотрипсичний гідроліз молока. 43 3- Електрофорез білкових гідролізатів. 46 4- Антигенність гідролізатів сироватки. 48 4-1 Анти-β-lg та анти-α-la сироваткові IgG. 48 4-2 Вимірювання реакційної здатності гідролізатів щодо антипротеїнових антитіл коров'ячого молока (β-lg та α-la). 48 4-3 Реакційна здатність гідролізатів бичачої сироватки. 48 4-4 Реакційна здатність гідролізатів верблюжої сироватки. 48 5- Тест на випробування in vitro. 51 5-1 Вплив на струм короткого замикання (Isc). 51 5-1-1 Вплив β-lg. 51 5-1-2 Вплив гідролізатів сироватки в коров’ячому молоці. 64 5-1-3 Вплив гідролізатів сироватки в верблюжому молоці. 64 5-2 Вплив на RFP. 64 5-3 Вплив на провідність (G). 64 5-4 Вплив на струм короткого замикання (Isc). 65 5-4-1 Ефект α-la. 65 5-4-2 Вплив гідролізатів сироватки коров’ячого молока. 65 5-4-3 Вплив гідролізатів молочної сироватки з молочного дроду. 65 5-5 Вплив на RFP. 66 5-6 Вплив на провідність (G). 66 Обговорення. 67 Висновок. 72 Бібліографічні посилання. 73
Література Рисунок 1: Механізм харчової алергії (Tanquet, Denery and Bodinier, 2004). 1-й контакт: Сенсибілізація: Розпізнавання алергену лімфоцитами. Інформація, що передається плазматичним клітинам. Плазмоцити утворюють IgE. IgE зв’язується з тучними клітинами. 2-й контакт: Спрацьовує: Спілка між алергеном та IgE спричиняє вибух тучних клітин, які виділяють хімічні речовини (гістамін,.) У походження симптомів. 4
Література Рисунок 2: Клітинний механізм оральної толерантності (Strober et al., 1998; Strobel and Mowat, 1998; Karlsson et al., 2001). DC: дендритна клітина. CD8 +: CD8 + хелперний Т-лімфоцит. Th2: цитокін типу Th2. Енергія: Стан невідповідності лімфоцитів, що характеризується відсутністю проліферації та низьким продукуванням IL2. Делеція: Смерть від апоптозу лімфоцитів Т. Запропоновано два механізми для пояснення клональної анергії: відсутність молекул костимуляції (B7.1 та B7.2) на поверхні клітин, що представляють антиген, та зв'язування B7 .2 до CTLA-4, який генерує інгібуючий сигнал до активованих Т-клітин. На периферії дендритні клітини індукують клональну анергію Т-клітин, що активуються після прихильності молекул B7.2 до CTLA-4. 5
Бібліографічні нагадування Єдиний продукт, ефективність якого була продемонстрована як з алергологічної, так і з точки зору харчування, продається під назвою NEOCATE, він існує у двох формах: у ранньому віці до 12 місяців та у формі на другий рік (норма або ароматизовані) (Molkhou, 2006). Козяче, овече або кобиляче молоко протипоказано через частоту перехресних алергій (Vitte, 2008). Суміші для немовлят на соєвій основі, хоча вони і адаптовані до харчування, не призначаються через високу частоту алергії на сою у дітей з APLV (Infante et al., 2003). Здається, верблюже молоко добре сприймається дітьми з алергією (Шабо та ін., 2005). Білки верблюжого молока не були розпізнані моноклональними антитілами анти-бичачого білка людського типу IgE, порівняно, звичайно, з білками козячого, овечого та буйволиного молока. Це, ймовірно, пояснюється відсутністю епітопів, гомологічних білкам коров’ячого молока через філогенетичну різницю (Restani et al., 1999). 8
Бібліографічні нагадування Таблиця 1: Середній склад верблюжого молока в Казахстані за період між 1905 і 2009 роками (Конуспаєва та ін., 2009). Роки Білок Жир Лактоза Загальна суха речовина Зола 1905-1969 3,7 ± 0,3 3,6 ± 0,8 5,1 ± 0,8 13,0 ± 0,5 0,75 ± 0,09 1972-1982 3,9 ± 0,8 4,5 ± 0,8 4,0 ± 0,6 12,9 ± 1,5 0,75 ± 0,12 1983-1992 3,2 ± 0,6 3,8 ± 0, 7 4,8 ± 0,6 12,8 ± 1,2 0,78 ± 0,06 1993-2006 3,1 ± 0,4 3,6 ± 1,3 4,4 ± 0,5 11,4 ± 1,4 0,80 ± 0,06 2007-2009 3,0 ± 0,5 3,0 ± 0,5 3,9 ± 1,0 11,1 ± 2,0 0,77 ± 0,09 Значення в таблиці представляють середні значення та стандартні відхилення складу верблюжого молока у відсотках. 11
Бібліографічні нагадування Рисунок 3: Перетравлення білків (Денис Річард, 2006). Просвіт кишечника: Травлення відбувається переважно за допомогою протеолітичних ферментів підшлункової залози. Білки перетворюються на олігопептиди та незначну частку амінокислот. Кордон пензля: Пептидази на кордоні кисті розкладають олігопептиди на дипептиди та трипептиди. Цитоплазма ентероцитів: Потім дипептиди та трипептиди гідролізуються в амінокислоти в ентероциті цитоплазматичною пептидазою. 16
Бібліографічні нагадування Рисунок 4: Схематичне зображення тривимірної структури трипсину, серинової протеази (Giansily-Blaizot et al., 2003). Стрілки позначають нитки β-аркушів, тоді як спіралі представлені спіралями. Використовується кольоровий код типу веселки, починаючи від синього (термінал N) і закінчуючи червоним (термінал С). Для наочності дві β-бочки пофарбовані в зелений та оранжевий кольори. Каталітична тріада представлена сірими трубками та кольоровими кульками (синій для атомів азоту, червоний для атомів кисню, чорний для атомів вуглецю). Β-нитки ідентифікуються буквою (аркуш A або B) та цифрою (порядок ниток на аркуші, від 1 до 7). 18
Бібліографічні посилання Рисунок 5: Схематичне зображення структури хімотрипсину, серинової протеази (Branden and Tooze, 1996). Домен 1: термінал C (S195: Serine 195). Домен 2: N термінал (H 57: Гістидин 57 - D 102: Аспартат 102). Коли він згортається, хімотрипсин приймає конформацію, яка відповідає двом структурним доменам: N кінцевому домену і C кінцевому домену. 19
Бібліографічні нагадування A- B- Рисунок 6: A- Спосіб дії трипсину. B- Спосіб дії хімотрипсину. Arg: Аргінін, Lys: Лізин, Glu: Глутамат, Phe: Фенілаланін. Трипсин діє на пептидні зв’язки, карбонова група яких походить від лізину або аргініну. Хімотрипсин ефективніше розщеплює пептидні зв’язки, карбонову функцію яких забезпечують ароматичні амінокислоти (тирозин, фенілаланін і триптофан). 21
Матеріали та методи DROM MILK AD AIRE V AC HE Молоко Центрифугування при 3500 об/хв при 4 C протягом 15 хвилин Знежирене молоко Додавання 1N HCl І центрифугування при 3500 об/хв при 10 C Протягом 15 хвилин Супернатант Гранула сироваткового казеїну Діаліз Ліофілізація Рисунок 7: Протокол для приготування сироватки з дромедару та коров’ячого молока. 23