Представлено Майклом Преукшасом, який народився у Бремені - PDF скачати безкоштовно
Дезоксигіпузінсинтаза як можлива мішень для лікування мультиформної гліобластоми та роль фактора ініціювання трансляції еукаріотичного процесу eif-5a2 in vivo для здобуття звання доктора природничих наук на кафедрі біології факультету математики, інформатики та природничих наук Гамбургського університету представлений Майклом Преукшасом, який народився 27 вересня 1981 року в Бремені, Гамбург 2012
Виправлена версія Дата суперечки: 30.08.2013 1-й рецензент: проф. Д-р Йоахім Хаубер 2-й рецензент: проф. Джулія Кер ii
Велика трагедія науки - вбивство прекрасної гіпотези потворним фактом ". Звернення президента Томаса Генрі Хакслі до Британської асоціації за 1870 р.," Біогенез та абіогенез "(Збірник есе, том 8) iii
Список скорочень 6! Під час2 цієї2 роботи2виготовлено2 публікацій2і! Презентації плакатів2. 2100! 7! Література2. 2102! 8-й! Додаток2. 2115! 8,1! Послідовності праймерів 2. 2115! 8,2! Lentiral2 вектори2. 2116! 8,3! eifj5ajexpression2in2glioblastomen2 (база даних Rembrandtjdata) 2. 2117! 8,4! Афідавіт2страхування2. 2122! iv
Список скорочень TMZ TPZ ВООЗ Темозоломідні клітини, що розмножуються пухлиною Всесвітня організація охорони здоров'я (Всесвітня організація охорони здоров'я) iii
Підсумкові стенди. За допомогою цієї миші-нокаута можна отримати нові знання про системні та орган-специфічні функції ссавців. iii
Ініціація частково виражена на рівні мрна, але майже не виявляється на рівні білка 5,6,8. Обидва білки кодуються власним геном і кожен транскрибується у п’ять транскриптів. Транскрипти іноді мають різні 3 -UTR або усічені, що впливає на швидкість трансляції та утворення полісом eif-5a2-mrna, зокрема у випадку транскриптів eif-5a2, і, можливо, бере участь у регуляції виразу 8. Eif-5a2-mrna також має нижчу стабільність, ніж eif-5a. Таким чином, принаймні частина різного вираження двох ізоформ, здається, можна пояснити цими посттранскрипційними механізмами. Фермент DHS відповідає за перший етап синтезу гіпузину. Більшість еукаріотів мають один ген dhps, збережений у еукаріотів та архей, який кодує DHS. Наразі у людини було знайдено три варіанти розшифровки, з яких, однак, лише один кодує активний білок 9. Поліамін-спермідин служить субстратом для DHS. Перенесення амінобутилового залишку від спермідину до eif-5a-лізину 50 є НАД-залежним процесом і в принципі оборотним. DHS є
Вступ для зменшення пов’язаної з апоптозом смерті клітин острівців підшлункової залози. Роль eif-5a у запальних реакціях, які мають вирішальне значення для розвитку діабету, також була відображена в інших сценаріях. Форма CNI-1493, призначена для прийому всередину, під назвою CPSI-2364 була протестована для лікування хвороби Крона, аутоімунного хронічного запального захворювання кишечника. Тут також був показаний протизапальний ефект, який був пов’язаний з пригніченням DHS. Гіпотеза про те, що білки eif-5a та гіпузиноутворюючі ферменти беруть участь у патогенезі багатьох злоякісних новоутворень, підтверджується все більшою кількістю досліджень. Тому оцінка участі цих білків в інших видах раку була очевидним вибором. Тут особливий інтерес становили злоякісні новоутворення, для яких на сьогодні доступно лише кілька ефективних терапевтичних варіантів. До них належать, зокрема, пухлини головного мозку вищого ступеня, лікування яких рідко буває успішним, незалежно від того, хірургічно це, за допомогою класичної радіо/хіміотерапії або цільової молекулярної терапії. Отже, eif-5a1/2, DHS та DOHH досліджувались як потенційні терапевтичні мішені при астроцитомах вищого класу. 9
Введення конкретних онкогенів кожному пацієнту буде необхідним з огляду на неоднорідність між пухлинами. Оскільки в пухлині GBM 120 також спостерігається велика неоднорідність і, можливо, клональний розвиток, і часто не всі мутації можна виявити за допомогою біопсії 121, нові, економічно ефективні технології (наприклад, секвенування екзома) та націлювання, ймовірно, будуть різними, непотрібні цілі допомагають подолати ці труднощі. 18-го
Матеріал та методи 19 2 Матеріал та методи 2.1 Матеріал 2.1.1 Хімічні речовини та середовища для бактерій Таблиця 2: Хімічні речовини та реагенти, використані у цій роботі. Хімічна речовина/Реагент/Середній розчин ECL Акриламід-Біс, 30% Адріаміцин (Доксорубіцин) Агароза Ампіцилін BCNU Реагент Брадфорда BSA Бромфенол Синій CHAPS Хлороформ Хлорохін Дифосфат DEPC-Вода DMEM + Глютамакс ДМСО ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Теляча сироватка (FCS) Глутаральдегід (50%) Гліцин Гліцерин Гемал відповідно до Mayer Ізопропанол Калій ацетат калію Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Niger Roth Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Roth Roth Roth Roth Roth 19
Матеріал і методи 20 Калій хлорид LB агар LB середовище Сухе знежирене молоко β-меркаптоетанол Метанол (MeOH) M-MuLV Ацетат натрію Хлорид натрію Гідроксид натрію Натрію ортованадат Неесенціальні амінокислоти Оліго d (t) Праймер Параформальдегід PBS Пеніцилін/Стрептоміцин Ріблоккол АБС Rotiszint eco plus соляна кислота (HCl) SDS SOC середовище спермін спермідин SYBR Green PCR Master Mix TEMED Темозоломід Тритій спермідин Tris Base Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Бейкер Ферментас Рот Рот Дж. Бейкер Sigma-Aldrich Gibco Invitrogen Sigma-Aldrich Lonza Gibco GE Healthcare Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Fermentas Roth Roth Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Roth Roth Finnzymes Roth Sigma-Aldrich Perkin-Elmer Sigma-Sigma-Aq
Матеріали та методи 21 Трипановий синій TritonX-100 0,5% трипсин + ЕДТА Твін20 Сечовина Біохром Sigma-Aldrich Gibco Roth Sigma-Aldrich 21
Матеріали та методи 22 2.1.2 Обладнання та матеріали Матеріали та обладнання, які не перелічені, є стандартним лабораторним обладнанням Таблиця 3: Обладнання та матеріали, що використовуються у цій роботі. Обладнання/матеріали Кріовіальні культурні слайди, 4 камери Проточний цитометр FACSCalibur камери електрофорезу FUSION SL Advance Гель документація Кабінет Eagle Eye II GenePulser XCell Гомогенізатор Omni TH Іммоболон PVDF мембрана Mastercycler Градієнт Мікропланшет зчитування Wallac Victor мікроскоп Культура клітин Аксіоверт 40 міліметрів, ND 1000 джерело живлення PowerPac NuPage поліакриламідні гелі ProteanXL Розмір ExtraThick Blot Paper Realtime PCR-Cycler Mx3000P рентгенівські плівки рентгенівська касета TransBlot SemiDry-Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cell XR клітинні колби колби, різні розміри клітинна культура посуд та тарілки 58 Центрифуга 5810C Центрифуга 5810C Центрифуга 5810C Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulter Sarste dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22
Матеріали та методи 23 2.1.3 Буфери та розчини Якщо не вказано інше, для приготування використовували фільтровану Millipore H 2 O, і розчини зберігали при кімнатній температурі (RT) ". Таблиця 4: Використовувані буфери та розчини Розчин Бактеріальна робота Розчин для суспензії Склад 50 мм Глюкоза 25 мм Трис, рН 8,0 10 мм ЕДТА, рН 8,0 Зберігання при 4 C лужному лужному лізисному буфері 0,2 N NaOH 0,5% SDS буфер осадження 25% 5M KAc 15% HCl TE буфер Молекулярна біологія 50x TAE біохімія білка 100% трихлороцтова кислота (TCA ) 0,1 мм EDTA 10 мм Tris (pH 7,5) 242 g Трис основа 57,1 ml ацетату 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H 2 O до 1000 мл 40 g TCA 20 мл H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Трис основа 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O до 100 ml 23
Матеріали та методи 24 1,5 М Трис 27,23 г Трис основа 80 мл H 2 O pH 8,8 H 2 O до 100 мл 5x SDS буферний буфер 360 г гліцину 75 г Трис основа H 2 O до 1000 мл буфер рівноваги 1 0,375 M трис-HCl (ph 8,8) 6 M сечовини 20% гліцерину (об/об) 2% SDS (w/v) 130 мм DTT буфер для врівноваження 2 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M сечовини 20% гліцерину (об/об) 2% SDS (в/в) 135 мм йодоацетаміду PBST 2000 мл PBS 1 мл буфера сечовини Твін20 8 M сечовини 2 M тіосечовини 2% CHAPS 50 мм DTT напівсухий промокальний буфер 25 г SDS 5,82 г Трис основа 2,93 г гліцину 1,90 мл 20% SDS 200 мл метанолу H 2 O до 1000 мл зберігання при 4 C 24
Матеріали та методи 25 Буфер для лізису клітин (RIPA) 150 мкл 1 М NaCl 50 мкл 1 М Трис-HCl (ph 7,6) 50 мкл 20% Нонідент P40 (об/об) 25 мкл 10% Na дезоксихолату Na (об/об) 10 мкл інгібітора протеази та 1000 мкл H 2 O клітинного циклу, апоптоз і буфер вилучення ДНК 192 мл 0,2 М Na 2 HPO 4 8 мл 0,1% Тритон Х-100 (об/об) рН 7,8 розчин йодиду пропідіуму 200 мкг йодиду пропідіуму 1 мг РНКази 10 мл Фіксуючий розчин PBS 0,25% глутаральдегіду (250 мкл) 2% параформальдегіду (1 г) PBS (pH 5,5; 50 мл) 20x ціанід калію (KC) 820 мг K 3 F (CN) 6 1050 мг K 4 FE (CN) 6 x 3H 2 O 25 мл PBS 40x X-GAL 40 мг 5-бром-4-хлор-3-індоліл β-d-галактозид 1 мл N, N-диметилформамід 2.1.4 Олігонуклеотиди Використовувані олігонуклеотиди Розроблено за допомогою програмного забезпечення Primer3 122, якщо це можливо. Властивості праймерів для гомологічних рекомбінацій (зокрема, схильність до утворення димеру) визначали за допомогою програмного забезпечення Oligoanalyzer 1.2 (Freeware, T. Kuulasmaa, University of Turku, Finland). 25-й
Матеріал та методи 26 2.1.5 Антитіла Таблиця 5: Первинні та вторинні антитіла, що використовуються для імуноблотів та FACS. Наводяться цільовий білок, господар походження, використовуване розведення та виробник. Виробник розведення антитіл-господарів Анти-миша HRP Вівця 1: 10000 GE Healthcare Анти-кролик HRP Коза 1: 10000 Клітинні сигнальні технології Anti-eIF-5A Кролик 1: 5000 Novus Anti-DHS Кролик 1: 1000 Санта-Крус Anti-DOHH Кролик 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 Rabbit 1: 1000 Santa Cruz Anti-p21 Waf1/Cip1 Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-AKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pAKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-Rb Rabbit 1: 1000 клітинних сигнальних технологій Anti-pRB Кролик 1: 1000 клітинних сигнальних технологій анти-β-тубулінова миша 1: 10000 онкоген Антиактивна-каспаза3- кроляча 1: 5 BD Pharmingen PE IgG 1 -PE Ізотип миша 1: 5 BD Pharmingen Контроль 2.1.6 Середовище для культури клітин Таблиця 6: Середовища культури клітин, що використовуються в цій роботі, та їх склад. Розчин Gliommedium Склад Dulbeccos модифікований Eagle середовище 4500 mg/l глюкоза L-глутамін 1 mm піруват натрію 1: 100 пеніцилін/стрептоміцин 10% FCS астроцитна середовище DMEM/F-12 4500 mg/l глюкоза 1 mm L-глутамін 26
Матеріал і методи 27 1 мм піруват натрію 1: 100 пеніцилін/стрептоміцин 20% FCS DMEM Ростова середовище Дульбекко модифіковане середовище Eagle 4500 мг/л глюкоза 1 мм L-глутамін 1: 100 пеніцилін/стрептоміцин 10% FCS (20% FCS для NHA) морозильне середовище FCS 10% DMSO DMEM-ES середовище Модифіковане середовище Eagle від Dulbecco (25 мм HEPES) 15% FCS 2 мм L-глутамін 0,1mM MEM 0,05 мг/мл суміш нуклеозидів пеніцилін/стрептоміцин (аденозин 1,3 мкг/мл; гуанозин 1, 37 мкг/мл; цитидин 1,18 мкг/мл; уридин 1,18 мкг/мл; тимідин 0,38 мкг/мл) 1 мМ піруват натрію 100 мкм 2-меркаптоетанол 1000 Од/мл ESGRO-LIF додаткова добавка для селекції: 150 250 мкг/мл G418 KSOM/HEPES середовище, рН 7,4 95 мм NaCl 2,5 мм KCl 350 мкм KH4PO4 200 мкм MgSO 4 середовище для MEF (живильні клітини) DMEM 9% FBS 0,1 мм NEAA 50 U пеніцилін/50 мкг/мл стрептоміцину Ембріональне середовище стовбурових клітин 27
Матеріали та методи 28 DMEM 25 мм HEPES 15% FBS 2 мм L-глутамін 0,1 мм NEAA 50 U пеніцилін/50 мкг/мл стрептоміцину нуклеозидна суміш (1,3 мкг/мл аденозину; 1,37 мкг/мл гуанозину; 1, 18 мкг/мл цитидину; 1,18 мкг/мл уридину; 0,38 мкг/мл тимідину) 1 мМ піруват натрію 100 мкм β-меркаптоетанол 1000 Од/мл ESGRO-LIF 28
Матеріал та методи 29 2.1.7 Використані клітини Клітинні лінії та первинні клітини, використані в цій роботі, перелічені в таблиці 7. Первинні мишачі ембріональні фібробласти (MEF) також використовувались як живильні клітини для культивування клітин ES. Таблиця 7: Клітинні лінії, використані в цій роботі, а також їх поживні середовища та походження. Клітинна лінія середнього джерела Phoenix Eco ϕ - (модифікований HEK293T, стабільно трансфікований двома плазмідами, що кодують послідовності вірусу MML для "gag", "pol" та "env".) DMEM Стенфордський університет (США) U87-MG (Клітинна лінія астроцитоми людини, що приєдналася до людини)., виділений з астроцитоми IV ступеня ВООЗ. Відповідні мутації: Видалений локус Ink4Arf) Середовище гліоми ATCC (номер: HTB-14) G55T2 (Прилипша лінія клітин астроцитоми людини, виділена з астроцитоми IV ступеня ВООЗ точкові мутації в ДНК-зв'язуючому домені) Gliommedium Neurosurgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf; Вестфаль 1994 NHA (нормальні астроцити людини, первинні, диференційовані астроцити з тканини мозку людини) астроцитна середовище Invitrogen (Дармштадт; N7805-100) C57BL/6N JM8.F6 клітини (мишачі ембріональні стовбурові клітини) DMEM-ES середовище W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Інститут, Каліфорнія, США 29
Матеріал та методи. Для електрофоретичного розділення білків використовували 12% поліакриламідні гелі на основі SDS. Скляні пластинки поміщали в ливарну підставку і розділяючий гель (10 мл) змішували з наступних розчинів: 3,35 мл H 2 O 4 мл 30% акриламіду 2,5 мл 1,5 М Tris-HCl (pH 8,8) 50 мкл 20% SDS 50 мкл 10% APS 10 мкл TEMED Суміш виливали між скляними пластинами і покривали 1 мл ізопропанолу, поки вона не полімеризувалася приблизно через 20 хвилин. Збірний гель (4%, 5 мл) тим часом склали: 3,05 мл H 2 O 0,66 мл 30% акриламіду 1,25 мл 0,5 М Tris-HCl (pH 6,8) 25 мкл 20% SDS 5 мкл ТЕМЕД Після видалення ізопропанолу та промивання розділювального гелю водою, збираючий гель виливали на розділюючий гель і вставляли кишенькову гребінець (10 кишень, товщина 1,5 мм). Через 20 годин гель поміщали в проточну камеру і наповнювали поточним буфером. Приготування зразка 5-кратний завантажувальний буфер і 20-кратний денатураційний агент (обидва від Fermentas, St. Leon-Roth) змішували з бажаним обсягом білкового лізату і доводили до бажаного об'єму (10 50 мкл) буфером RIPA. Суміш кип'ятять протягом 5 хвилин при 95 ° С для денатурації білків, а потім зберігають на льоду. 36
Результати 73 AB маса тіла [г] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 мг GC7 0,15 мг GC7 0,2 мг GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 днів маса пухлини [г] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 мг GC7 0,15 мг GC7 0,2 мг GC7 Рис.: 20 Послідовність випробувань експериментів на ксенотрансплантатах in vivo та вплив GC7 на моделі ксенотрансплантата in vivo G55T2 на вагу тварин та масу пухлини. (A) Тестова послідовність експериментів in vivo на ксенотрансплантаті з клітинами G55T2. Клітини G55T2 вводили підшкірно дорсально мишам NSG. Після успішного росту та формування пухлини GC7 вводили внутрішньовенно внутрішньовенно щодня. вводиться. Після семи днів лікування пухлини готували, зважували, вимірювали та зберігали для екстракції білка/імуногістохімічного фарбування. Статус гіпузину (і, отже, ефект GC7) визначали за допомогою 2D вестерн-блот (B) курсу маси тіла мишей NSG після підшкірного введення клітин G55T2 та щоденної обробки 0,1 мг, 0,15 мг, 0, 2 мг GC7 або PBS як контроль розчинника (середнє значення ± SEM). (C) вага пухлини через 7 днів лікування GC7. (Вага окремих пухлин та середнє значення/когорта ± SEM). Видиме лікування (наприклад, кошлате хутро, потерті ділянки). BehaV 73 теж
Результати 75 3.3 Створення миші-нокаута eif5a2 3.3.1 Створення цільової конструкції eif5a2 На основі інформації про послідовність гена eif5a2 (назва мишачого гомолога до гена людини eif-5a) було обрано стратегію клонування та область послідовності, яку слід видалити. Ця область включає екзони 13 і закриває Рис.: 22 Схематичне зображення субклонування гомологічною рекомбінацією. Лінійний мінімальний вектор (чорний) з гомологічними областями (синій) до BAC електропортується в клон E. coli, який несе BAC із сегментом ДНК, який слід модифікувати (сірий). таким чином, починається трансляція і лізину 50 в екзоні 2, який несе критичну модифікацію гіпузину. Як описано в розділі 1.2.7, BAC RP23-361F2 служить відправною точкою для клонування векторної конструкції. Тут був використаний метод рекомбінації (клонування за допомогою гомологічної рекомбінації) (приклад на рис. 22). Цілісність гена eif5a2 в BAC вперше була підтверджена секвенуванням. Потім мінімальний вектор pstartk ампліфікували за допомогою ПЛР і за допомогою праймерів додавали плечі гомології, розташовані 5 і 3 гена eif5a2. Продукт ПЛР аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі 75
Публікації та презентації на стенді, отримані в результаті цієї роботи. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 Презентація плакатів Селекторний фенотип, пов’язаний з теломерами (TASP), співпрацює з BCR- ABL сприятиме злоякісній проліферації мишачих гемопоетичних стовбурових клітин Мелані Брейг, Нора Пеллман, Майкл Преукшас, Доріс Штейнеман, Енн Гомпф, Карл Л. Рудольф, Андреас Шуперт, Стефан Балабанов та Тім Х. Брюммендорф Презентація постера в підготовці
Додаток 115 8 Додаток2 8.1 Послідовності праймерів ef5a2 побудова нокауту: Назвіть праймер секвенування eif5a2 у pstartk pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd Праймер для додавання гомологічних рукавів до eif5a2 або до касет опору A2 Primer1 A2 Primer2 eif5a2. -для eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r ґрунтовка зонда 3'-probe3-f 3'-probe3-f Подальші послідовності грунтування pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ori послідовності (5'-3 «-r A2-A2 TK6-3'-F-R-TK6-3 ') tgacagcagacgtgcactgg СТС GGG CCC САА ATA ATG AT gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg tggattgctgtc tataaacccgcagtagcgtg 115