Рада директорів проф.

Від Медичної клініки для дрібних тварин, кафедри внутрішньої медицини дрібних домашніх тварин та домашніх тварин ветеринарного факультету Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені. Катрін Хартманн Зроблено під керівництвом проф. Катрін Хартманн Генетичні та поживні фактори розвитку цукрового діабету у собак: Дослідження поліморфізму чотирьох генів-кандидатів та надходження вітаміну D Інавгураційна дисертація на здобуття ветеринарної доктора ветеринарного факультету Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені, представлена ​​Яннісом Урігом з Карлсруе, Мюнхен 2007

директорів

Надруковано з дозволу ветеринарного факультету Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені Декан: Спікер: Співреферент: Університет-Проф. Лікар. Є. П. Мертлбауера, проф. Лікар. Гартманн проф. Д-р День кандидата наук Гольдберга: 20 липня 2007 р

Ми знаємо, що змушує квіти рости, але ми не знаємо, чому всі ми маємо знання про ДНК, але ми все одно помираємо Джастін Салліван Декларуючи сумнів як філософію життя, все одно, що вибрати нерухомість як транспортний засіб Янн Мартель На згадку про моя мати

4.5. Вимірювання рівня 25 (ОН) вітаміну D 3. 61 4.6. Вимірювання рівня вітаміну D 3 на 1,25 (OH) 2. 62 V. Дискусія. 64 1. Порівняння методів генотипування. 64 2. Етіологія цукрового діабету у людей та собак. 65 2.2 Генетичні фактори розвитку цукрового діабету. 65 2.3 Стан вітаміну D як поживний фактор у розвитку діабету. 68 3. Обмеження цього дослідження. 69 3.1. Номер тварини. 70 3.2. Колектив пацієнтів. 70 3.3. Контрольна група. 71 3.4. Вивчати дизайн. 72 4. Актуальність цього дослідження. 72 5. Перспектива. 73 VI. Резюме. 76 VII. VIII. Резюме. 78 Бібліографія. 80

Алфавітний перелік абревіатур 7-DHC: 7-дегідрохолестерин ADA: Американська діабетична асоціація ВІК: вдосконалений глікозильований кінцевий продукт ALP: Аланін-Амінотрансфераза AP: Лужна фосфатаза APC: Антиген-презентуюча клітинна зброя: Ампліфікаційна система тугоплавких мутацій CTLA4: Цитотоксична T-лімфоцитна цитоксика: Пороговий цикл DDG: Німецьке діабетичне товариство DKA: Діабетичний кетоацидоз DLA: Антиген лейкоцитарних клітин собаки D. m.: Цукровий діабет EDTA: Етилендіамінтетраоцтова кислота EPI: Екзокринна недостатність підшлункової залози GAD65: Глутамат людська декарбоксилаза GH: Гормон росту ХГВ ХГВ Варіант розвитку Лейкоцитарний антиген IA-2/ICA-512: Тирозин-фосфатаза IBD: Запальна хвороба кишечника ICA: Антиген клітин островів IDD: Інсулінодефіцитний діабет IDDM: Інсулінозалежний цукровий діабет IFN-γ: Інтерферон-γ IL-2: Інтерлейкін-2 IRD: Інсулінорезистентний діабет ISAG: Міжнародне товариство генетики тварин LADA: Латентний аутоімунний діабет у дорослих LYP: Лімфоїд-Тирозин-Фосф atase MHC: Основний комплекс гістосумісності MODY: Діабет зрілого віку молодих РС: розсіяний склероз

NADPH: знижений нікотинамід аденин динуклеотид NIDDM: інсулінонезалежний цукровий діабет NO: оксид азоту АБО: співвідношення шансів NPH: ізофан-інсулін ПЛР: полімеразна ланцюгова реакція PP: панкреатичний поліпептид PTH: паратиреоїдний гормон PZI: протамін-цинк-інсулін RXR: Ретиноїд X-рецептор SD: стандартне відхилення SNP: однонуклеотидний поліморфізм T1DM: цукровий діабет I типу TBE: TRIS-борат-EDTA TE: TRIS-EDTA TGF-β: трансформуючий фактор росту β TNF-α: фактор некрозу пухлини-α VDR: вітамін D- VDRE-рецептор: Елементи, що реагують на вітамін D VIP: вазоактивний кишковий поліпептид VUW: Університет ветеринарної медицини, Відень ВООЗ: Всесвітня організація охорони здоров’я

II. Огляд літератури 4 Електронний мікроскоп однорідно непрозорий, дрібні гранули зберігаються і складають близько 5% клітин острівців. Найменша і дуже неоднорідна група ендокринних клітин підшлункової залози, клітини РР, виділяють шлунково-панкреатичні поліпептидні гормони, наприклад, поліпептид підшлункової залози (РР) або вазоактивний кишковий поліпептид (VIP). Ендокринні клітини підшлункової залози оточені щільною мережею фенестрованих капілярів і виділяють свій секрет у кров шляхом екзоцитозу. Їх неможливо відрізнити за фарбуванням гематоксилін-еозином, але їх можна дуже добре ідентифікувати за допомогою імуногістохімічного фарбування гормонів, які вони виробляють (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Інсулін Інсулін - пептидний гормон, що має велику гомологію між різними видами ссавців. Собачий інсулін за своєю послідовністю ідентичний інсуліну свині (www.ebi.ac.uk/swissprot). Він діє через свій рецептор як на гомеостаз глюкози, так і на метаболізм жирів, білків і кетонових тіл. 1.3.1. Утворення інсуліну та секреція інсуліну Інсулін утворюється у вигляді попереднього проінсуліну в ß-клітинах підшлункової залози, а у собак складається з 106 амінокислот, які утворюють сигнальну послідовність, а також ланцюг A та B, який зв’язаний проміжною ланкою, так званою C- Пептид, що зв’язується. Проінсулін 82 амінокислот утворюється шляхом відщеплення сигнальної послідовності та утворення трьох дисульфідних містків. У подальшому процесі процесу С-пептид відщеплюється, і отриманий інсулін, який у собак складається з 51 амінокислоти (SMITH, 1966), зв'язаний з іоном цинку як гексамер, зберігається в гранулах на клітинній поверхні і, як реакція на підвищення рівня цукру в крові, зберігається разом із С- Пептид виділяється в кров в еквімолярних кількостях. Оскільки утворення інсуліну з його попередників за допомогою так званих прогормон-конвертаз відбувається лише в гранулах для зберігання, якщо секреція інсуліну швидка, проінсулін також виділяється в кров; однак він має незначну біологічну активність. Крім того, різні білки з гранул потрапляють в кровообіг. Більшості відводиться роль у встановленні оптимальних умов зберігання та переробки інсуліну. Однак не можна виключати, що деякі з них також можуть виявляти біологічну активність. Один

II. Огляд літератури 8, а також звуження капілярів в клубочку та сітківці. Ця біохімічна реакція, ймовірно, сприяє значній частині довгострокового пошкодження D. m. Відомо і страшно у людей, таких як артеріосклероз, діабетична нефропатія та діабетична ретинопатія (VLASSARA et al., 1986). Оскільки всі ці ускладнення розвиваються лише протягом декількох десятиліть, вони клінічно менш важливі для собак (FELDMAN & NELSON, 2004). Довгострокові наслідки D. m., Що стосуються собаки, описані в розділі 1.6.3. мав справу з. При нормальному рівні цукру в крові лише близько 3% глюкози розщеплюється за допомогою так званого сорбітолу шляхом ферменту альдозоредуктази до сорбіту і, нарешті, до фруктози. У гіперглікемічному стані це значення збільшується до 30%. Оскільки NADPH (відновлений нікотинамід адениндинуклеотид) споживається під час розщеплення глюкози шляхом поліінозитолу, у клітині виникає дефіцит NADPH. NADPH є субстратом для глутатіонпероксидази, який захищає клітину від вільних радикалів і, отже, від пошкоджень, спричинених окислювальним стресом. Таким чином, підвищена активність альдозоредуктази, яка, як підозрюється, також бере участь у формуванні AGE, може сприяти пошкодженню ендотелію судин і, отже, вищезгаданим ускладненням D. m. У людини (SRIVASTAVA et al., 2005). Ці механізми, здається, також мають незначне значення у собачих D. m. Через короткий термін життя собаки, але шлях сорбіту, схоже, відіграє важливу роль у формуванні діабетичної катаракти як у собак, так і у людей (LIGHTMAN, 1993; WILKIE та ін., 2006). 1.5. Епідеміологія цукрового діабету собак Згідно з американським дослідженням, яке ретроспективно порівнювало розподіл собак за породом із D. m. З розподілом порід собак, представленим у тій самій клініці з інших причин протягом 1970-1999 років, дванадцять порід мали особливо високий ризик розвитку D. m. (австралійський тер’єр, середній шнауцер, самоїд, мініатюрний шнауцер, фокстер’єр, кешхонд, бішон-фріз, фінненшпіц, керн-тер’єр, мініатюрний пудель, сибірський хаскі, іграшковий пудель). Більшість собак на момент постановки діагнозу мали вік від п’яти до десяти років, найбільша поширеність D. m. У віковій групі від одинадцяти до 15 років (GUPTILL et al., 2003).

II. Огляд літератури 10 1993). Гіперліпідемія - це лабораторні результати, які часто можна спостерігати, оскільки посилений ліполіз в крові призводить до підвищення рівня вільних жирних кислот при нестачі інсуліну. Гіперліпідемія призводить до збільшення накопичення жиру в печінці і, отже, до печінкового ліпідозу (JAMES & DAY, 1999). Це призводить до підвищення активності печінкових ферментів лужної фосфатази (AP) та аланінамінотрансферази (ALT). У дослідженні 208 собак з D. m., 90% всіх собак продемонстрували збільшення активності АР та 78% збільшення активності АЛТ, у 42% собак сироватка була ліпемічною (HESS et al., 2000) . 1.6.2. Основні захворювання Гормональні впливи, ліки та захворювання підшлункової залози та інших органів можуть призвести до D. m. В принципі, D. m. На основі інсулінорезистентності є оборотним, і в тих випадках, коли є гіперадренокортицизм або підвищена потреба в інсуліні в діеструсі, раннє лікування основного захворювання або негайна кастрація іноді може призвести до переходу від тимчасового до постійно проявляється D. .m., якого слід уникати. Однак у більшості випадків занадто багато β-клітин вже загинуло через токсичність глюкози або вичерпання їх секреторної здатності, щоб підтримувати достатню секрецію інсуліну, так що оборотний інсулінорезистентний D. m. Стає незворотним інсулінодефіцитним діабетом (FELDMAN & NELSON, 2004; NORMAN та ін., 2006). 1.6.2.1. Гострий та хронічний панкреатит Гострий або хронічний панкреатит - загальні захворювання, які призводять до руйнування ендокринних клітин підшлункової залози і, отже, до відсутності секреції інсуліну; новоутворення екзокринної підшлункової залози трапляються рідко (ALEJANDRO et al., 1988). Гострий панкреатит, як правило, призводить до швидкого руйнування β-клітин і, отже, до відсутності секреції інсуліну, тоді як хронічний панкреатит є найважливішою причиною інсулінорезистентності, пов'язаної із запаленням (FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.2.2 Гіперадренокортицизм Глюкокортикоїди, що виробляються організмом або надходять ятрогенно, призводять до підвищення рівня цукру в крові через посилений глікогеноліз та глюконеогенез. Вони діють як антагоніст інсуліну і можуть призвести до D. m. Крім того, глюкокортикоїди призводять до а

II. Огляд літератури 14 мікроальбумінурія, спостерігається підвищена продукція трансформуючого фактора росту β (TGF-β). Цей фактор росту відповідає за посилене позаклітинне відкладення білків матриксу в клубочку; це призводить до потовщення базальної мембрани та розширення мезангії (SCHENA & GESUALDO, 2005). Оскільки тривалість початкової фази становить близько п’яти років, а діабетична нефропатія повністю розвивається лише приблизно через 20 років, це трапляється дуже рідко через коротший термін життя домашніх собак (STRIPPOLI et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.3.6 Діабетичний кетоацидоз DKA - це небезпечний для життя зрив метаболізму організму через необроблену або погано контрольовану D. m., Що характеризується біохімічною тріадою гіперглікемії, ацидозу та кетозу. Як вже було описано, нестача інсуліну та глюкози в периферичних клітинах тіла призводить до посиленого ліполізу та утворення кетонових тіл у печінці, оскільки вільні жирні кислоти окислюються до ацетил-КоА, який не додається до циклу лимонної кислоти через брак глюкози в клітині і метаболізується до слабких кислот ацетону, ацетоацетату та β-гідроксибутирату. Цей ефект посилюється збільшенням концентрації гормонів-антагоністів інсуліну (особливо глюкагону та глюкокортикоїдів), а посилений глюконеогенез та глікогеноліз призводять до подальшого підвищення рівня цукру в крові. Це призводить до осмотичного діурезу, втрати електролітів та дегідратації (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). Кетонові тіла можуть використовуватися багатьма клітинами організму, в тому числі в головному мозку, для вироблення енергії, але якщо вони утворюються в надлишку, вони сприяють серйозному виходу з ладу метаболізму організму. Вони діють як слабкі кислоти і, отже, призводять до виснаження буферних систем у крові і, отже, до метаболічного ацидозу. Вони вільно фільтруються через клубочок і завдяки своїй гідрофільності посилюють осмотичний діурез. Через негативний заряд кетонових тіл з крові в сечу виділяються такі катіони, як натрій і калій, а також кальцій і магній, щоб підтримувати електронейтральність крові. Це призводить до виснаження натрію та калію в організмі та подальшого, сильного зневоднення. Якщо приплив глюкози в клітини організму відсутній, калій не може потрапити в клітину, оскільки це можна зробити за допомогою

III. Матеріали та методи 40 або були направлені до клініки лікарями загальної практики лише тоді, коли виникли ускладнення. 1.1.3. Розподіл раси та статі 13 собак були змішаними породами; найпоширенішими племінними собаками були такси, вест-хайлендські білі тер’єри та пуделі (по чотири пацієнти) та німецькі вівчарки (троє пацієнтів, див. таблицю 2). Найчастіше були представлені породи дрібних тер’єрів (вест-хайлендські білі тер’єри, йоркширські тер’єри, джек-рассел-тер’єри, а також вельш-тер’єри та скотч-тер’єри із загальною кількістю десяти пацієнтів). Породи собак з Мюнхенської клініки для дрібних тварин перелічені окремо в табл.3, щоб мати можливість порівняти їх з найпоширенішими породами всієї популяції пацієнтів клініки з медичних дрібних тварин протягом досліджуваного періоду. 28 собак з D. m. Були самками, з яких 15 були кастровані і 13 некастровані, 23 собаки з D. m. Були самцями, з яких одинадцять стерилізованих, а дванадцять ні. Таблиця 2: Найпоширеніші породи собак із цукровим діабетом (вся популяція досліджень) Порода Кількість змішаних порід 13 Такса 4 Пудель 4 Вест-Хайленд Уайт-тер'єр 4 Ротвейлер 3 Німецька вівчарка 3 Йоркширський тер'єр 2 Джек-Рассел-тер'єр 2 Інше 16

III. Матеріали та методи 50 ампліфікат. Оскільки ефективність зв'язування праймерів була різною, значення C t відрізнялися, незважаючи на однакову кількість ДНК у різних алелях, тому Ct 1 C) повинна відрізнятися за температурою плавлення. Оптимальна температура відпалу та концентрація специфічних для алелю праймерів повинні бути оптимізовані в кількох попередніх випробуваннях (LINDBLAD-TOH et al., 2005). Функціонуючий підхід міг бути встановлений лише для одного з ОНП; праймери та умови реакції наведені в табл. ПЛР проводили на 96-лункових планшетах (Thermowell Gold PCR Plates, Corning Inc., Corning, USA) за допомогою термоциклера AB 7300 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, США). За ПЛР послідувала стадія дисоціації, на якій температуру плавлення продуктів ПЛР визначали, використовуючи градієнт температури (60-95 С). Або негативна перша похідна кривої флуоресценції показала пік при нижчій температурі плавлення, потім посилився коротший амплікон і зразок містив аденин або тимін на місці SNP, або був пік з більш високою температурою, тоді зразок був гомозиготним для гуаніну або цитозину. Гетерозиготні тварини показали два піки, по одному піку при відповідній температурі. Грунтовки були отримані від Operon Biotechnologies GmbH в Кельні, Німеччина. Було використано Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, США). Для того, щоб мати можливість порівняти цей новий метод генотипування з ARMS-PCR, SNP V7 генотипували за допомогою обох методів.

III. Матеріал та методи 55 Таблиця 9 SNP V7 Крива плавлення ПЛР; Праймер, програма ПЛР, реакційна суміш, друкований жирним шрифтом: Базовий обмін Праймер 1 (специфічний для алеля) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Праймер 2 (для специфічного алелю) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT загальний праймер AGTCAGGTGCCCTCCTCCTTTGG 60 сек синтезу 72 C 30 сек партія H 2 O 7,8 мкл (20 мкл) праймер 1 (10 мкм) 0,4 мкл праймер 2 (5 мкм) 0,4 мкл загальний праймер (10 мкм) 0,4 мкл 2x SYBR-Green Mastermix 10 мкл ДНК-шаблон 1 мкл 2.8. Статистика Статистична оцінка проводилася за допомогою SPSS для Windows, версія 13.01 (SPSS Inc., Чикаго, США). Непарний t-тест Стьюдента використовували для порівняння середніх значень вітаміну D, а тест χ 2 для порівняння частот алелів. Р 0,05 вважали значущим. Аналіз випробовуваної міцності та необхідної кількості тварин проводили за допомогою Power And Precision (Biostat Inc., Englewood, США).

IV. Результати 56 IV. Результати 1. Секвенування пар праймерів було створено загалом для 18 сегментів генів VDR, CTLA4, LYP-PNP та DLA, сегменти ампліфікували за допомогою ПЛР та очищали, реплікаційну ДНК секвенували. Пари праймерів були підібрані таким чином, щоб якомога більше порцій усіх екзонів та меж екзону-інтрону були посилені. 1.1. Послідовність гена рецептора вітаміну D Коли порівнювали секвенировані сегменти гена, у гені VDR було виявлено сім SNP, три з них в інтронах, три в екзонах і один у нетранслірованій 5 області (рис. 1). Рис. 1: Однонуклеотидні поліморфізми (стрілки) у гені рецептора вітаміну D (кодуючі області (екзони), позначені сірими рамками) 1.2. Послідовність гена цитотоксичного Т-лімфоцитного антигену 4 У гені CTLA4 було виявлено два SNP, один в екзоні 2 і один в екзоні 4 (фіг. 2). Рис. 2: Однонуклеотидні поліморфізми (стрілки) в цитотоксичному гені антигену 4 Т-лімфоцитів (області кодування (екзони), позначені сірими рамками)

IV. Результати 57 1.3. Секвенування гена лімфоїдної тирозин фосфатази A SNP було виявлено в гені LYP, він знаходився в екзоні 13 і привів до амінокислотного обміну (фенілаланін> лейцин). Рис. 3: Однонуклеотидні поліморфізми (стрілки) в лімфоїдному тирозинфосфатазному гені (області кодування (екзони), позначені сірими ящиками). перераховані в табл.10. Таблиця 10 Локалізація однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) (UTR = нетранслируемая область, AS-Aust. = Амінокислотний обмін, PPA = Primer-Probe-Assay, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Крива плавлення-PCR, Phe = Фенілаланін, Leu = лейцин) ген SNP-області AS-Aust. ПЛР V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - послідовний V10 c.677t> c exon 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 c.958a> g exon 4 CTLA4 - ARMS LYP c.2344a> t exon 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA