Роланд Ліблау Ульріх Бланк Ганс Іссель Ульріх Бланк Ганс Іссель Лоран Ребер Ерік Сальваторе Ерік -
постійний безлад або хороша їжа, яка завжди приносила нам додому протягом багатьох років. Дякую вам обом за всі ці гарні часи (навіть якщо подяки занадто поширені). Одрен (ні, в його імені немає вини) та Саймон (президент комітету з повернення c café rue saint michel), дякую вам обом за всі хихикання, які ми мали. Я також дякую своїм друзям з дитинства, яких я втратив з поля зору з часів Родеза, але вони все ще присутні: Грегуар, Джордан та П'єр-Лю.
3- Взаємодія тучних клітин з іншими акторами імунної системи. 69 3-1 Взаємодія між тучними клітинами та CD4 + TH-лімфоцитами 69 3-1a Формування імунологічного синапсу 3-1b Підтипи Т-лімфоцитів та їх регуляції 3-1c Тучні клітини як клітини, що представляють антиген 3- 2 Взаємодія з ендотеліальними клітинами та рекрутингом лейкоцитів ... 77 4- Завдання дисертації 79 4-1 Частина 1: Вивчення динаміки дегрануляції тучних клітин ... 79 4-2 Частина 2: Аналіз впливу ейкозаноїдів на диференціювання Т-лімфоцитів-помічників. 80 Результати. 81 Частина 1: Вивчення динаміки дегрануляції тучних клітин . 82 1- Дегрануляторний синапс тучних клітин . 83 2- L IL-33 тонко регулює дегрануляцію та вироблення хемокінів на рівні “одиничних клітин”. 106 Обговорення та перспективи (частина 1) 151 Частина 2: Вплив ейкозаноїдів на співпрацю між тучними клітинами та лімфоцитами T Helper 157 Обговорення та перспективи (частина 2) 177 Висновок.181 Бібліографія. 183 Додатки. 214 Сторінка 2
Список абревіатур SCF: фактор стовбурових клітин CLP/CMP: загальний лімфоїдний/мієлоїдний попередник MEP: мегакаріоцит/еротроцитарний попередник GMP: гранулоцитарний/моноцитарний попередник BMCP: базофіл/попередник тучних клітин MITF: фактор транскрипції, пов'язаний з мікрофтальмією, RFc: рецептор постійного фрагменту M мітоген-активована протеїнкіназа ROCK: Rho-асоційована спіральна спіраль-утворююча протеїнкіназа S1P: сфінгозин 1-фосфат GRB2: зв’язаний з рецептором фактору росту білок 2 PI3K: фосфатидилінозитол 3-кіназа JAK-STAT: перетворювач сигналу кінази сигналу і антиватор транскрипції BMMC: тучні клітини кісткового мозку LT: Т-лімфоцити MMC9: багатофункціональні слизові тучні клітини, що продукують IL-9 NG: фактор росту нерва CTMC: тучна клітина сполучної тканини MMC: тучні клітини слизової оболонки PCMC: тучні клітини перитонеальної клітини CBMC: тучна клітина, отримана з пуповинної крові новий стимулюючий фактор LTC 4: лейкотрієн C 4 NK: природний кілер LPS: ліпополісахарид Сторінка 3
TNF- фактор некрозу пухлини CMV: цитомегаловірус PGD2: простагландин D2 TSLP: стромальний лімфопоетин тимусу MrgX2: ген, пов’язаний з Mas X2 CGRP: пептид, зв’язаний з геном кальцитоніну VIP: вазоактивний кишковий поліпептид, кишковий вазоактивний пептид ІМТ: імуномотивуючий ІМТ: ІМТ: імуномотивуючий ІМТ: ІМТ: імуномотивуючий ІМТ: ІМТ: мотив інгібування на основі імунорецепторів тирозину LAT: лінкер для активації Т-клітин GADS: пов'язаний з GRB2 адаптерний білок SHC: SH2-домен-вмісний трансформуючий білок C SLP76: SH2-домен-вмісний білок лейкоцитів 65 кда PLC 1: фосфоліпаза C 1 NTAL: лінкер для активації не-клітин LAB: лінкер для активації В-клітин IP3: інозитол-1,4,5-трифосфат DAG: діацилгліцерол PKC: протеїнкіназа C PI3K: фосфатидилінозитол 3-кіназа BTK: тирозинкіназа Бертона STIM - 1: молекула стромальної взаємодії-1 ET: позаклітинна пастка GAG: глікозаміноглікани SNARE: розчинний рецептор білка, що приєднується до N-етилалейміду, чутливий до фактора VAMP: везикулярно-асоційована мембрана pro tein SNAP23: білок, асоційований із синаптосомою 23 mmcp: протеаза тучних клітин миші PAR2: рецептор, що активується протеїназою 2 HSP70: білок теплового шоку 70
PUFA: поліненасичені жирні кислоти, поліненасичені жирні кислоти COX: циклооксигеназа LOX: ліпооксигеназа MCET: позаклітинна пастка тучних клітин АФК: активні форми кисню, реактивні форми кисню EAE: експериментальний аутоімунний енцефаломієліт SMAC: надмолекулярний кластер активації TFA: T клітинний рецептор LFA: -1: антиген, асоційований з функцією лімфоцитів 1 STAT: сигнальний перетворювач та активатор транскриментації Еомес: еомезодермін Ав .: Авідін ДОДАТКИ: антитілозалежний дегрануляторний синапс PGE2: простагландин Е2 15d-PGJ2: 15-Дезокси-Дельта-12,14 -простагландин J2 Сторінка 5
Малюнок 23: Біосинтез ейкозаноїдів та їх рецепторів. Малюнок 24: Взаємодія між S. pyogenenes та BMMC. Малюнок 25: Імунологічний синапс між CD4 + Т-лімфоцитом людини та APC. Малюнок 26: Схематична організація імунологічного синапсу. Малюнок 27: Різні популяції CD4 + Т-лімфоцитів. Малюнок 28: Диференціація лімфоцитів CD4 + T H. Малюнок 29: CD4 + Т-лімфоцити поляризують свою секреційну техніку до ПКМС, що представляють антиген. Малюнок 30: Організація кровоносних судин. Рисунок 31: L ДОДАЄ дегрануляторний синапс для виділення секрету та захисту. Рисунок 32: Схема двох механізмів, що регулюють дегрануляцію тучних клітин, опосередковану агрегацією RFc I. Сторінка 7
Вступ Сторінка 11
Малюнок 3: Дві моделі диференціації тучних клітин. (A) Модель, яку захищають Chen et al. MCP отримуються безпосередньо з MPP. (B) Модель, яку захищають Arinobu et al. MCP походять від BMCP, загальних родоначальників тучних клітин і базофілів. Розвиток тучних клітин у людини аналізувати складніше. Тучні клітини людської тканини також відрізняються від попередників від гемопоетичних стовбурових клітин [14]. Ці попередники циркулюють у крові та характеризуються експресією CD34, CD117, CD13 або навіть CD133 [15,16]. Сторінка 16
Рисунок 4: Рецептор SCF та його сигналізація в тучних клітинах. Схема Гіліфана та співавт. [29] Дерегуляція цього сигнального шляху та/або мутація рецептора c-kit беруть участь у багатьох патологіях, таких як мастоцитоз. Ця патологія характеризується накопиченням тучних клітин у багатьох органах та неналежним вивільненням медіаторів з цих клітин. У деяких з цих пацієнтів були виявлені мутації рецептора c-kit, найпоширенішою з яких є мутація D816V, яка індукує конститутивне автофосфорилювання рецептора. Тому ми можемо бачити абсолютне значення цього сигнального шляху у всій фізіології тучних клітин. Ця сигналізація вимагає тонкої регуляції, яка в разі відмови може мати серйозні наслідки для організму. Інші фактори розвитку та диференціації тучних клітин Тучні клітини диференціюються під впливом багатьох інших факторів, які зможуть модулювати їх розвиток.Я буду детально представляти деякі з цих посередників, а в таблиці 1 узагальнено всі фактори розвитку. Сторінка 18
Малюнок 11: Рецептори, здатні модулювати активацію тучних клітин людини. Адаптовано за Бреддінгом та Артуром [84] Сторінка 45
Малюнок 15: Світлові клітини, витягнуті з очеревини щурів, міченої авідином. Зображення взято з Tharp et al. [284] Як пояснювалось у розділі результатів, наявність авідину, сполученого з флуорохромом під час активації тучних клітин, дозволило нам розкрити процес екзоцитозу гранул тучних клітин людини в режимі реального часу (рис. 16). Сторінка 49
Рисунок 20: Морфологія гранул. (A) Трансмісійна електронна мікроскопія тучної клітини з гранулами типу “кристал” (суцільні стрілки) та “сувій” (порожні стрілки), модифікована Dvorak et al. [288]. (B) Електронна мікроскопія вмісту тучної клітини з гранулами I, II та III типу [319]. Сторінка 56
Фігура 21: Гранули тучних клітин щурів після стимуляції сполукою 48/80. Адаптовано з Кундера та ін. [377] Гранули тучних клітин представляють справжній арсенал і беруть участь у великій кількості імунних та неімунних функцій (рис. 22). Нові покоління мишей, що дозволяють специфічну делецію генів у тучних клітинах, безсумнівно, дасть можливість у найближчі роки виявити навіть нові функції цих секреторних гранул та взаємодії, яку вони можуть мати із своїм найближчим та віддаленим середовищем. Сторінка 62
Малюнок 24: Взаємодія між S. pyogenenes та BMMC. (A) Електронно-мікроскопічне зображення неінфікованого BMMC, (B) S. pyogenenes, прикріпленого до поверхні BMMC, (C) скупчення бактерій, захоплених MCET, (D) BMMC, що виробляє MCETs з бактеріями (стрілки). Адаптовано за von Köckritz-Blickwede та ін. [417] Сторінка 68
Малюнок 26: Схематична організація імунологічного синапсу. Адаптовано з Валітутті та іспанської мови, Енциклопедія наук про життя 2005 3-1b Підпопуляції Т-лімфоцитів та їх регулювання Набір сигналів необхідний для активації Т-лімфоцитів та індукції його диференціації. Перший сигнал подається шляхом розпізнавання TCR з його певним пептидним/cmh комплексом. Другий - це комбінація костимулюючих молекул, таких як зв'язування між CD80/86 з CD28, експресоване на LT [422]. Третій сигнал відповідає цитокінам, що виділяються APC, які модулюють відповідь LT і спрямовують його до певної диференціації. Під час взаємодії між наївним LT та його APC, задіяні сигнали визначають підтип Т-лімфоцитів, а також клональне розширення та частку генерованих ефекторів або клітин пам'яті [423]. Комбінованої експресії певних маркерів (CD3, CD4, CCR7, CD45RA, CD45RO) в даний час достатньо для розрізнення наївних Т-клітин, ефекторних LT, CM LT та EM LT у зразках крові (рис. 27). Сторінка 70
Малюнок 27: Різні популяції CD4 + Т-лімфоцитів. Діаграма, взята з дисертації доктора Н. Гауденціо CD4 + TH-лімфоцити, як відомо, має велику різноманітність підтипів диференціації, в даний час близько шести підтипів вважаються власними лініями (рис. 28). Ці визначені лінії представляють архетипи, між якими коливаються популяції LT. Сторінка 71
Малюнок 28: Диференціація лімфоцитів CD4 + T H. Діаграма, адаптована з Брумлі та співавт. [424] Підводячи підсумок, перші дослідження з диференціювання CD4 + Т-лімфоцитів змогли виявити, що активація наївної LT з дендритною клітиною, що продукує IL-12, індукувала здатність LT виробляти IFN-. [425,426], ці клітини називали лімфоцитами TH 1. На відміну від них, лімфоцити TH 2 диференціюються в присутності IL-4 і секретують IL-4, IL-5, IL-10 та IL-13, але не д. IFN- [425,426]. Ця сильна опозиція між цими двома лініями була підтверджена тим фактом, що характерні для кожного лінії цитокіни блокують протилежну лінію. Ці перші дослідження заклали основи для вивчення диференціації CD4 + LTs, а ідентифікація нових цитокінів дозволила розробити ці різні підтипи лімфоцитів H T. Я опишу тут приклад диференціації щодо лінії TH 1. відомі дані, але кожна лінія зараз має безліч регуляторів як цитокінів, так і генетичних. Як згадувалося раніше, IL-12 є першим сигналом, який відіграє центральну роль в індукції T H 1 [427]. Пізніше IFN-, сигнальний цитокін T H 1, також був Сторінка 72
Результати Сторінка 81
Частина 1: Вивчення динаміки дегрануляції тучних клітин Сторінка 82
1 Дегрануляторний синапс, що залежить від антитіл до тучних клітин, поляризований та захисний секрет. Сторінка 83
Інтернет-додатковий матеріал Додатковий Рис. 1. Фенотипова та функціональна характеристика первинних ліній hmc. (а) Аналіз проточної цитометрії експресії CD117, Fc RI та Fc RIIA на поверхні hmc. (b) Гістохімічне фарбування hmc толуїдиновим синім. (c) Фарбування триптазою тучних клітин (зелена) та хімазою (червона) шляхом непрямої імунофлуоресценції після фіксації та проникнення. Зразки перевіряли за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа. Ізотип-відповідні контрольні антитіла не виявляли фарбування. (d) Внутрішньоклітинний цитометричний аналіз експресії триптази та хімази за допомогою hmc. (e) Викликаний секретагогом вивільнення гексозамінідази. hmc стимулювали збільшенням концентрації речовини P або сполуки 48/80 протягом 30 хв при 37 C. Тести на фенотиповий та функціональний аналіз hmc регулярно проводили через 8 тижнів культури. Дані отримані з одного репрезентативного експерименту з принаймні трьох. Сторінка 95
Додаткова Рис. 2. Стимуляція hmc з низькою концентрацією антигена призводить до утворення екзоцитозованої гранули корони. (a) IgM, сенсибілізовані IgE, стимулювали за допомогою анти-ige mab (0,06 мкг мл -1) в буфері Tyrode, що містить авідин-сульфородамін (Av.SRho). Стимул був доданий в момент 0 часу зйомки. Панелі показують послідовність знімків одного репрезентативного фільму з 3 (див. Додатковий фільм 2). Зображено прогресивне утворення корони з дегранульованого матеріалу. Батончики, 5 мкм. (b) Вимірювання інтегральної інтенсивності флуоресценції (IFI) мастоцитів Av.SRho за допомогою функції вимірювання області програмного забезпечення Metamorph (дані подано з додаткового фільму 2) Сторінка 96
Додаткова Рис. 3. Гранулярна корона, що утворюється на поверхні тучних клітин при дегрануляції, може бути візуалізована за допомогою аналізу зв’язування з Анексином-V. (a) IgM, сенсибілізовані IgE, стимулювали за допомогою анти-ige mab (2,5 мкг мл -1) у буфері Tyrode, що містить анексин-v-a647. Стимул був доданий в момент 0 часу зйомки. Панелі показують послідовність знімків одного репрезентативного фільму з 3 (див. Додатковий фільм 3). Зображено прогресивне утворення корони з дегранульованого матеріалу. Батончики, 5 мкм. (b) Вимірювання інтегральної інтенсивності флуоресценції (IFI) маст-клітин annexin-v-a647 з використанням функції вимірювання області програмного забезпечення Metamorph (дані наведено у Додатковому фільмі 3). Сторінка 97
Додаткова Рис. 4. Кінетика вивільнення -гексозамінідази після стимуляції анти-ige mab. IgE, сенсибілізований hmc, стимулювали 2,5 мкг мл -1 анти-іге мабіл в тих самих експериментальних умовах, що використовувались для експериментів з уповільненою мікроскопією в момент часу 0. Супернатанти збирали у зазначений час після стимуляції та вимірювали вивільнення гексозамінідази. Результати побудовані як середнє значення ± SEM з трьох незалежних експериментів. Сторінка 98
Додаткова Рис. 5. Тренінг ADDS, який контролюється за допомогою аналізу зв’язування annexin-v. Hmcs, сенсибілізовані проти CD20-IgE, інкубували з CD20 + B-клітинами в буфері Tyrode, що містить annexin-v-a647 (a) або annexin-v-a647 плюс Av.SRho (b). Живі клітини знімали протягом 30 хв за допомогою конфокального мікроскопа LSM710 (див. Додаткові фільми 6 та 7). На панелях показано послідовність знімків, що відображають взаємодію між hmc та В-клітиною. Результати отримані з одного репрезентативного експерименту з трьох. Батончики, 5 мкм. Сторінка 99
Додаткова Рис. 6. 3D-кількісне визначення поляризованої дегрануляції. Анти-CD20 IgE, сенсибілізовані hmcs, інкубували з CD20 + В-клітинами (співвідношення 1: 1) в буфері Tyrode плюс Av.SRho. (а) Приклад кон'югату, що демонструє поляризовану дегрануляцію (Av.SRho, червоний); пунктирними лініями позначені проаналізовані обсяги. Батончики, 5 мкм. (b) Схема, що зображує синаптичний та дистальний обсяги, де інтенсивність флуоресценції Av.SRho аналізували за допомогою інструменту статистики рентабельності інвестицій програмного забезпечення ICY. (c) 13 кон'югатів було проаналізовано на інтенсивність флуоресценції 3D Av.SRho; стовпчики позначають середнє значення; Результати двох експериментів. Парний t тест ***, P 0,05; * Р 0,05; * Р 0,05; * Р 0,05; * P 0,05 * P 0,05 * P 0,05 * P 0,05 * P 0,05. Сторінка 173
Рисунок S5: 15d-PGJ2 не впливає на частоту різних лімфоцитів H T. 5x10 4 CD4 + пам'ять T лімфоцитів стимулювали протягом 6 днів 5x10 4 hmc IFN, завантаженим або не SAg, у присутності контролера транспортного засобу, індометацину або d індометацин плюс зазначені концентрації 15d-PGJ2 у середовищі диференціювання. На D6 клітини стимулювали коктейлем з РМА/іономіцину протягом 5 годин, а вміст внутрішньоцитоплазматичного цитокіну аналізували за допомогою проточної цитометрії. Частота субпопуляцій LT H на D6 під контролем + умови транспортного засобу (сині крапки) або в присутності індометацину (червоні точки) або в присутності індометацину + 15d-PGJ2 (рожеві точки). Результати виражаються як медіана, нормалізована до стану контроль + транспортний засіб, і кожна точка представляє іншого донора LT. Статистичні відмінності оцінювали за допомогою парного критерію t Стьюдента, ns P> 0,05 * P