Розкриття топографії нейронних схем у багатоколірному протоколі (переклад на французьку)
Резюме
Ми пропонуємо практичний посібник для доставки індикаторів in vivo та використання спіноцеребелярного шляху як модельної системи, щоб продемонструвати основні кроки для успішного аналізу нейронних ланцюгів у мишей. Ми детально описуємо наш універсальний протокол відстеження, який використовує агглютинін зародків пшениці (WGA), кон’югований з флуорофорами Alexa.
Анотація
Протокол
1. Запропонуйте індикатори in vivo за допомогою стерильної хірургії (розділи з 01.01 по 01.16)
Протягом усієї процедури ми радимо застосовувати стандартні стерильні хірургічні методи. Сюди входить використання стерильних рукавичок, сукні та маски для обличчя. Інструменти перед використанням слід або автоклавувати, або мити водою, а потім етанолом. Під час хірургічного втручання, а особливо між тваринами, фрагменти тканин очищають інструменти та стерилізують інструменти сухим кульовим стерилізатором (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). Крім того, важливо організувати робочий простір таким чином, щоб у вас були відведені місця для підготовки тварин (гоління тощо), хірургічного втручання та зони відновлення, де тварина може бути легко перевірена, зігріта та забезпечена знеболюючими засобами за необхідності. Ключ до виживання успішних операцій - зменшення ризику зараження та підтримка агресивної стратегії післяопераційного догляду. Будь ласка, зверніться до таблиці, де ви можете знайти все обладнання та реактиви, необхідні для цього протоколу.
2. Виявлення антероградно простежених мохових волокон
4. Мікроскопія та аналіз даних
Всі дослідження на тваринах проводились відповідно до протоколу IACUC на тваринах, затвердженого відповідно до інституційних вказівок в Медичному коледжі Альберта Ейнштейна. Самці та самки інбредних швейцарських мишей Webster (Taconic, Олбані, Нью-Йорк) або інбредних мишей C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) утримувались у нашій колонії та використовувались для всіх досліджень. Опівдні дня, коли була виявлена вагінальна пробка, вважалося ембріональним днем 0,5.
5. Репрезентативні результати:
Тонкі спіноцеребелярні афференти в татальних парасагібандах мозочка (рис. 3; Voogd та ін. 1969; Grishkat та Eisenman 1995; Vogel та Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps and Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010; . Reeber et al (al 2011). Ми ввели індикатори WGA-Alexa у нижній відділ грудного відділу поперекового відділу спинного мозку, щоб продемонструвати: 1) що ці індикатори можна використовувати для позначення певних підмножин терміналів мозочка (рис. 3; Reeber et al 2011), 2). що індикатори WGA-Alexa надзвичайно яскраві і можуть бути використані для візуалізації загальної картини топографії мохових волокон цілого мозочка (рис. 3;. Reeber et al. 2011), 3) що можна використовувати WGA-Alexa 488 і 555 в поєднанні для відстеження множинних шляхів у однієї і тієї ж тварини (рис. 4) та 4) індикатори WGA-Alexa сумісні з імуногістохімічним фарбуванням (рис. 5). У нещодавніх роботах ми показали, що термінали для слідування міток WGA-Alexa в мозочку вже через 6 годин після доставки індикатора до спинного мозку і є прекрасним вибором для відстеження архітектури шляхів розвитку (Reeber et al., 2011).
Рисунок 2 Ілюстрація нижньої частини грудної клітки -. Поперековий верхній відділ хребця до та після дорсальної ламінектомії схема сегмента AT. хребет інтактний з нижньої деревно-грудно-верхньої області хребта миші B. Дорсаламінектомія L проводиться шляхом видалення остистих відростків одного або двох сегментів хребця після прорізування середини між суглобовою пластинкою та остистим тильним відростком.
Рисунок 3. Плоттери WGA-Alexa надзвичайно яскраві і можуть бути використані для візуалізації аферентної проекційної топографії з високою роздільною здатністю. AT. Діаграма ілюструє походження та припинення позначених WGA-Alexa 555 спиноцеребелярних нейронів. Картина B. з місця ін’єкції після доставки WGA-Alexa 555 у поперекову, верхню нижню грудну область спинного мозку дорослого. VS. Зображення передніх часточок Wholemount після ін’єкції WGA-Alexa 555 в нижню частину грудної клітки над поперековою частиною спинного мозку. D. WGA-Alexa 555 антероградне відстеження спинно-мозочкових шляхів виявляє смуги мохоподібних волокон, як це видно на кооперативному зрізі Рональної тканини. Частинки визначаються римськими цифрами, а смуги - це номери етикеток мохових волокон по обидва боки від центральної лінії (стосується всіх зображень). Шкала шкал: B, C 500 мкм, 500 мкм D, 200 мкм.
Малюнок 4. Індикатори WGA-Alexa ефективні для маркування багатьох нервових шляхів у однієї і тієї ж тварини. AT. Цілісна схема мишачого мозочка, що узагальнює загальний малюнок хребтово-мозочкових смуг мохових волокон. WGA-Alexa 555 вводили в праву частину поперекового відділу спинного мозку, а WGA-Alexa 488 - в той самий сегмент з лівого боку. B. Як видно на ділянці коронарної тканини, прорізаної через задні часточки, обидва індикатори WGA-Alexa були перевезені в мозочок і правильно позначені окремими підмножинами терміналів (див. Також Reeber et al. 2011). Скорочення: шар таупекулера (мл); Клітинний шар Пуркіньє (PCL); гранулярний клітинний шар (GCL); біла речовина (WM). Шкала шкал: B, 100 гм.
Малюнок 5. Індикатори WGA-Alexa можна використовувати в поєднанні з імуногістохімією та гістологією для потрійного маркування нейронів та проекцій. AT. WGA-Alexa 555 осідає в кінцях мохоподібних волокон на часточці III. B. Забарвлення ZebrinII виявляє безліч клітин Пуркіньє в смужках часточки III. VS. DAPI фарбування ядер нейронів та гліальних клітин. D. Злитий образ панелей A, B,, і VS демонструє потрійне мічення аферентних смуг, смуг клітин Пуркіньє та загальної цитоархітектури. EH. Зображення з великим збільшенням областей коробки, показані в D панелі. Смуги клітин Пуркіньє нумеруються, як було описано раніше (розглянуто в (Apps and Hawkes 2009)). Скорочення: молекулярний шар (мл); Клітинний шар Пуркіньє (PCL); гранулярний клітинний шар (GCL). Шкала шкал: D, 500 мкм (змінного струму), H, 500 гм (для EG).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Ми описали хірургічні та технічні деталі, необхідні для успішного відстеження аксонів та дендритів, використовуючи новий флуоресцентний проекційний підхід до нейронного мічення у мишей, що розвиваються та дорослих. Використовуючи WGA-Alexa, ми показуємо, як маркери та маркери можуть бути використані для аналізу топографії візерункових схем з високою роздільною здатністю та у трьох вимірах.
Для відстеження нейронних ланцюгів доступно багато індикаторів, включаючи субодиницю холерного токсину В, біоцитин, нейробіотин, лейкоагглютинін Phaseolus vulgaris (PHAL), флуорорубін, флуорамералд і фтороголт. Крім того, останні генетичні та вірусні індикатори продемонстрували, що окремі молекулярно-нейронні підмножини топографічно пов'язані з їх цілями з великою точністю. Зауважте, що, хоча деякі нейронні індикатори переважно транспортуються або в антероградному, або в ретроградному напрямку (наприклад, 10000 МВт проти BDA 3000 МВт), молекули-індикатори часто транспортуються в обидві сторони. У наших дослідженнях ми вводимо індикатори на основі WGA-Alexa як надійні інструменти для нейроанатомічного аналізу топографічних проекційних моделей. Ми показуємо, що WGA-Alexa яскраво флуоресцирує, швидко транспортується і є досить універсальним, щоб поєднуватися з імуногістохімічними маркерами, включаючи маркери для сагітальних відділів мозочка (рис. 3).
Наш підхід до трасування волокон може бути легко адаптований для відстеження нейронних карт в кортикальних шляхах, стовбурі мозку та хребті. В даний час ми вивчаємо можливість використання індикаторів WGA-Alexa для візуалізації in vivo формування ланцюгів у генетично модифікованих тварин та вивчення динаміки формування ланцюгів після селективних уражень шляху та фармакологічних маніпуляцій. Оскільки швидкий транспорт індикаторів WGA-Alexa дозволяє проводити короткочасний аналіз, наш підхід може виявити динамічні зміни, які відбуваються під час структурної пластичності топографічних кіл.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.