Швидка ідентифікація дев’яти видів стрічкових черв’яків дифіллоботріїдів шляхом піросеквенування - повідомляє

швидка

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Обговорення
  • Матеріали і методи
  • Паразитні матеріали
  • Затвердження етики
  • Дизайн грунтовки
  • Екстракція ДНК, підготовка плазмід, ампліфікація ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та піросеквенування
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • Генетика паразитів
  • Доклінічні дослідження

Анотація

вступ

Результати

Повний розмір таблиці

Нуклеотидне вирівнювання мітохондріального гена cox1, отриманого з D. dendriticum, D. ditremum, D. latum, D. nihonkaiense, D. stemmacephalum, Di. balaenopterae, A. pacificus, S. decipiens et sp. проліферум. Суцільні стрілки вказують на положення Psedo_F (прямий праймер) та біотинільований Psedo_R (зворотний праймер). Поламана стрілка вказує на Psedo_S (праймер для секвенування). Область, позначена ящиками, вказує положення (881–921) цільової області, що використовується для ідентифікації, до рівня виду. Точки позначають однакові нуклеотиди між послідовностями. AM712906 (D. latum) - еталонна послідовність позицій нуклеотидів.

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

Пірограми 41 базового фрагмента гена cox1 D. dendriticum ( AT ), D. ditremum ( ), D. latum ( VS ), D. nihonkaiense ( D ), D. stemmacephalum ( Е ) Di. balaenopterae ( F ), A. pacificus ( G ), S. decipiens ( H ) і Sp. proliferum ( Я ). Показані теоретичні схеми пірограм (вгорі кожної панелі) та репрезентативні вихідні дані контрольних плазмід або аналітичних зразків з піросеквенування (внизу кожної панелі). Фактична послідовність, отримана піросеквенуванням, відображається на наступних панелях “Послідовні”. Вісь Y показує рівень флуоресценції, що випромінюється включенням нуклеотидної основи, а вісь X показує загальну кількість підстав, доданих на той момент. G, C, T, A, нуклеотидні основи. Підкреслені літери позначають нуклеотиди, що використовуються для ідентифікації дифіллоботріїдних стрічкових черв’яків.

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

Обговорення

Техніка піросеквенування, розроблена в цьому дослідженні, є інструментом з високою пропускною здатністю, який може бути виконаний за 4 години (без періоду вилучення ДНК) і дозволяє отримувати результати з 96 зразків одночасно. Орієнтовна орієнтовна вартість - 5 доларів за тест. Однак вартість може змінюватися залежно від комерційного походження використовуваних агентів. Окрім своїх медичних застосувань, цей метод піросеквенування може бути корисним для ідентифікації личинок, виділених з копепод, яєць та дорослих особин серед різних таксонів, що мають подібну морфологію. Піросеквенування є перспективною альтернативою високої пропускної здатності для молекулярного генотипування дев'яти видів дифіллоботріїдних стрічкових черв'яків і може мати важливе значення для епідеміологічних досліджень. Це стосується не лише ендемічних країн, а й неендемічних районів, де мандрівники з ендемічних районів заносять паразитів 5, 52 .

Матеріали і методи

Паразитні матеріали

Зразки дифіллоботріїдних стрічкових черв'яків (личиночні та дорослі стадії) відбирали у проміжних та остаточних господарів з різних географічних розташувань (табл. 1). Загалом 29 зразків дифіллоботріїдних стрічкових черв’яків, включаючи D. dendriticum, D. ditremum, D. latum, D. nihonkaiense, D. stemmacephalum, Di. balaenopterae, A. pacificus, S. decipiens et sp. proliferum досліджували (табл. 1). Досліджені в цьому дослідженні зразки дифіллоботріїду фіксували у 70% етанолі, за винятком A. pacificus, який фіксували у 10% формаліні.

Для оцінки специфічності праймерів використовували геномні зразки ДНК від недифілоботріїдних паразитів. Сюди входять зразки трокодів Strongyloides stercoralis, Ascaris lumbricoides, Capillaria philippinensis, Trichostrongylus sp.) Та найпростіших (Isospora belli, Giardia duodenalis). Також були проаналізовані зразки ДНК неінфікованих риб та людських лейкоцитів.

Затвердження етики

Усі методи протоколу дослідження були схвалені та застосовувались відповідно до діючих керівних принципів та правил етичного затвердження Комітетом з етики Національного інституту інфекційних хвороб, Токіо, Японія (№ 177). Жодних експериментів з участю людей не застосовувалось. Усі паразити були отримані з решти зразків (поінформована згода була отримана від усіх суб’єктів, а дані були проаналізовані анонімно) або з зразків, придбаних на ринках. Ми підтвердили, що в процесі не беруть участь зникаючі або охоронювані види.

Дизайн грунтовки

Дизайн праймера базувався на вирівнюванні нуклеотидів coxl D. dendriticum, D. ditremum, D. latum, D. nihonkaiense, D. stemmacephalum, Di. balaenopterae, A. pacificus (син. D. pacificum); та S. decipiens та Sp. proliferum (див. таблицю 2 для номерів приєднання до GenBank). Наступні праймери були розроблені з послідовності A. pacificus (номер приєднання GenBank AB548654): Наші набори праймерів (Psedo_F; 5′-TTTGGTTGTTGTGTGTGTGTGG-3 ′, що відповідає позиціям 846–865). Біотинільований Psedo_R; біотин-5′-GGCTCACGTAAAGAAACACGACT-3 ′, що відповідає позиціям 1010-988) і праймер секвенування Psedo_S (5′-GGGGTCATCATATATGTTTA-3 ′, що відповідає положенням 863–880) був розроблений разом з PyroModox, Уппсала, Швеція) (рис. 1). Diphyllobothrium latum (номер приєднання GenBank AM712906) - еталонна послідовність, яка використовується для визначення позицій нуклеотидів.

Екстракція ДНК, підготовка плазмід, ампліфікація ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та піросеквенування

Геномні зразки ДНК з 29 зразків дифілоботріїдів (табл. 1) витягували за допомогою набору DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Німеччина). Крім того, плазміди позитивного контролю для всіх видів дифіллоботріїдів отримували шляхом лігування кожного специфічного для виду амплікону у легкий вектор pGEM-T (Promega, WI), як це раніше описано в інших звітах 53. Кожен вставлений ген був секвенсований Сангером вперед і назад, і отримані послідовності були ідентичними послідовностям генів, з яких були сконструйовані праймери.

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Thanchomnang, T. et al. Швидка ідентифікація дев’яти видів стрічкових черв’яків дифілоботріїдів шляхом піросеквенування. Наук. Респ. 6, 37228; Doi: 10.1038/srep37228 (2016).

Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог в опублікованих картах та приналежності до інституцій.

коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Умов обслуговування та рекомендацій спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як невідповідне.