Удосконалена мишача модель для неалкогольного стеатогепатиту у поєднанні з діабетом 2 типу
Резюме
Описано просту і надійну модель фехтування, що викликається дієтою, для безалкогольного стеатогепатиту (НАСГ), що досягається завдяки утриманню тварин без SPF та введенню специфічної дієти з високим вмістом жиру. Ми описуємо ідентифікацію підгруп печінки та жирових клітин для рекапітуляції імунних станів людини, піддаючи мишей мікробам навколишнього середовища.
Анотація
Ожиріння пов’язане з хронічним запаленням низької ступеня тяжкості та резистентністю до інсуліну, що сприяє зростанню поширеності хронічних метаболічних захворювань, таких як діабет 2 типу та безалкогольний стеатогепатит (NASH). Недавні дослідження показали, що протизапальні імунні клітини інфільтруються в гіпертрофічну жирову тканину та печінку із ожирінням. З огляду на зростаючу роль імунних клітин у метаболічному гомеостазі, існує нагальна потреба кількісно визначити та охарактеризувати їх зміну у розвитку діабету 2 типу та НАСГ. Однак тваринні моделі, що викликають патофізіологічні особливості, типові для людського NASH, є рідкісними.
У цій статті ми пропонуємо детальний протокол для ідентифікації підмножин імунних клітин, виділених з печінки та жирової тканини, у надійній моделі мишей NASH, отриманої шляхом розміщення дієтичних мишей з високим вмістом жиру (HFD) під неспецифічними безпатогенними мікроорганізмами. (SPF) без блокування протягом щонайменше семи тижнів. Ми демонструємо обробку мишей у несолених умовах, перетравлення тканини та ідентифікацію макрофагів, природних клітин-кілерів (NK), дендритних клітин, підмножин В та Т-клітин методом проточної цитометрії. Надано репрезентативні ділянки потокової цитометрії від мишей SPF-HFD та мишей, що не мають SPF. Для отримання надійних та інтерпретованих даних використання антитіл, точних і точних методів перетравлення тканин та правильного вибору в експериментах з проточною цитометрією є вирішальними елементами.
Втручання з метою відновлення фізіологічного впливу антигену на мишей шляхом розміщення їх у неслов'янських умовах та неспецифічного впливу мікробних антигенів може бути важливим інструментом у вивченні взаємозв'язку між імунологічними змінами, спричиненими дієтою. Ожиріння та пов'язані з ним тривалі ускладнення.
Вступ
Ожиріння є багатофакторною хворобою та основним фактором ризику розвитку серцевих захворювань, інсульту, безалкогольного стеатогепатиту (NASH), діабету 2 типу (T2D) та деяких видів раку. Поширеність ожиріння швидко зростає у всьому світі. Сьогодні 2,1 мільярда людей - майже 30% світового населення - страждають ожирінням або мають надмірну вагу 1. Асоційована з ожирінням резистентність до інсуліну може призвести до T2D, коли виснажені бета-клітини підшлункової залози не зможуть компенсувати підвищену потребу в інсуліні для підтримки гомеостазу глюкози 2.
Жирова тканина складається з різних типів клітин, включаючи адипоцити, ендотеліальні клітини, фібробласти та імунні клітини. Під час прогресування ожиріння зміни кількості та активності імунних клітин можуть призвести до нижчого запалення гіпертрофічної жирової тканини 3, 4. Зокрема, було встановлено, що надмірне споживання енергії, що супроводжується хронічно підвищеним рівнем цукру в крові, тригліцеридами та вільними жирними кислотами, призводить до гіпоксії адипоцитів, стресу ендоплазматичної сітки, порушення функції мітохондрій та посилення секреції цитокінів, що призводить до активації протизапальних жирових клітин 5,6. До цього часу дослідження зосереджувались головним чином на вродженому імунітеті, але нещодавно адаптивні імунні клітини (Т і В-клітини) стали важливими регуляторами гомеостазу глюкози. Вони мають запальні функції (включаючи CD8 + Т-клітини, Th1 і B-клітини) або, перш за все, регуляторні функції (включаючи регуляторні Т-клітини (Treg), Th2-клітини) і можуть як посилювати, так і захищати резистентність до інсуліну 7,8 ., 9 вересня
Для вивчення різних підмножин імунних клітин в жировій тканині та печінці при розвитку інсулінорезистентності та NASH на вдосконаленій моделі миші, яка відтворює імунні умови людини, мишей поміщали в одинарні клітини в напівстерильних умовах без бар’єру. У мишей, яких утримували в умовах, що зазнали впливу антигену, розвинулася NASH-подібна патологія печінки лише через 15 тижнів дієти з високим вмістом жиру (HFD). Порівняно з мишами SPF, які відповідають віку, у них розвинувся макровезикулярний стеатоз, інфільтрація печінки та активація імунних клітин.
Цей рукопис описує надійний проточний цитометричний аналіз для визначення та підрахунку підмножин імунних клітин з жирової тканини та печінки миші на моделі NASH. Аналіз проточної цитометрії дозволяє одночасно визначати кілька параметрів окремих клітин, на відміну від підходів RT-PCR або імуногістохімії.
Підводячи підсумок, наше дослідження пропонує мишачу модель короткочасного ВЧС для вивчення розвитку інсулінорезистентності та NASH та основних механізмів, які також демонструють вірність стану людини.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Це дослідження було проведено відповідно до Посібника Національних інститутів охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин та Закону про захист тварин під наглядом нашого Комітету з питань захисту тварин. Протоколи тварин проводились згідно з інституційними етичними рекомендаціями Шаріте Берлін, схваленими Державним управлінням охорони здоров’я та соціальних питань та відповідають рекомендаціям ARRIVE.
1. Індукована дієтою тваринна модель стеатогепатиту
2. Приготування реагентів та розчинів
3-е покоління одноклітинних суспензій
5. Компенсація, придбання та регулювання проточної цитометрії
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Репрезентативні результати позаклітинного фарбування Т-клітин у мишачій печінці мишей, підданих HFD, показані на малюнку 3 A виявлено порівняно з HFD SPF мишами. Насправді, більший відсоток ефекторних запасів CD4 + і CD8 + Т-клітин можна виявити у мишей, що зазнали впливу HFD, тоді як внутрішньопечінкові наївні CD4 + і CD8 + Т-клітини були значно нижчими при впливі порівняно з мишами SPF. 7 тиждень (рисунок 3 А).
Для підтвердження цих результатів досліджували запальну реакцію печінки, пов'язану з впливом антигену, фарбуванням зрізів печінки мишей, яких годували протягом 15 тижнів 13. Важкий стеатоз, включаючи збільшення великих крапель ліпідів, що призводить до макровезичного стеатозу, запалення лобелії, гепатоцелюлярного балонування та порушеної лобуляції, був виявлений у мишей, що зазнали впливу HFD, тоді як лише у деяких мишей з SPF спостерігалося легке накопичення жиру в печінці (рис.3Б). Як на малюнку3C повідомив, частка NK-клітин у перигонадальній жировій тканині мишей, опромінених HFD, була вищою, тоді як миші HFD-SPF демонстрували більшу частку дендритних клітин. Істотних відмінностей у макрофагів та моноцитів не виявлено. Загалом, ці результати підтверджують більш важкий стеатоз печінки у мишей, що зазнали впливу HFD, і менші відмінності в жировій тканині між мишами, що зазнали HFD, та SPF.
Таблиця 1 показані антитіла, використані в таблиці 1. Антитіла, що використовуються в аналізі проточної цитометрії для позаекулярного фарбування В-клітин, макрофагів, NK-клітин, дендритних клітин та гранулоцитів, знаходяться в Таблиця 2показано.
Зображення 1 : Схематичне зображення стратегії воріт, що використовується для аналізу проточної цитометрії ожиріння (Таблиця 1). Спочатку клітини замикаються на синглети. Потім бруд усувається за допомогою зони розсіювання вперед (FSC-A) та зони бічного розсіювання (SSC-A) та вибору правильного розміру. Клітини також характеризуються експресією CD45. Життєздатні клітини відбирають за допомогою маркера живих/мертвих клітин, барвника амінової реакції, який не призначений для живих клітин, але призначений для клітин із порушеними мембранами. Т-клітини розділили на цитотоксичні Т-клітини (CD8 +) і Т-допоміжні клітини (CD4 +) та розділили на наївні (CD44 + CD62L-), центральне сховище (CD44 + CD62L +), ефекторне зберігання (CD44 + CD62L -) і ефекторні (CD44 - CD62L +) Т-клітини. Зрештою, клітини CD44 + замикаються на KLRG1, CD127 та PD-1. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.
малюнок 2 : Схематичне зображення стратегії ворота, що використовується при аналізі проточної цитометрії жирових клітин (Панель 2). Дендритні клітинні клітини базувались на експресії CD11b та CD11c. Були визначені наступні інші популяції: В-клітини, NK-клітини, макрофаги, моноцити та гранулоцити. Дані аналізували за допомогою відповідного програмного забезпечення після отримання. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.
малюнок 3 : Репрезентативний проточний цитометричний аналіз Т-клітин, виділених із мишачої перигонадальної жирової тканини та печінки. (A) CD4 + і CD8 + Т-клітини з миші печінки за 7 тижнів мишей HFD, що утримувались під SPF і в умовах впливу, аналізували за допомогою проточної цитометрії. B.) репрезентативне фарбування 15 тижнів HFD SPF та виставлених мишей. Інфільтрація імунних клітин та гепатоцитів харчових волокон (наконечники стріл) ілюструє NASH. C.) Частка вроджених імунних клітин ожиріння як відсоток лейкоцитів у мишей з HFD, що утримуються під SPF або піддаються впливу умов протягом 7 тижнів. n = 6-10 мишей на групу. Значимість визначали за допомогою двосторонніх багаторазових вимірювань ANOVA. Дані представлені як середнє значення ± SEM. * * P & lt; 0,01, * * * P 13 змінено. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Стеатогепатит має сильну взаємодію з порушеннями обміну речовин, такими як ожиріння, резистентність до інсуліну та дисліпідемія 15. Кілька досліджень показують, що запалення жирової тканини може спричинити патогенез діабету 2 типу, включаючи зміну кількості клітин як у вродженій, так і в адаптивній імунній системі 4, 5, 16, 17. Крім того, виявлено, що ожиріння модулює активацію імунних шляхів, що може призвести до ускладнень печінки 18. Інтерес до характеристики фенотипів імунних клітин при ожирінні та запаленні печінки зростає, оскільки кожна субпопуляція імунних клітин по-різному сприяє розвитку інсулінорезистентності та стеатогепатиту.
Цей метод дає детальну інформацію про те, як виділити та кількісно визначити відносну кількість імунних клітин із жирової тканини перигонади та печінки. Крім того, методи показують, як мишей, що харчуються HFD, можна утримувати в несашеїчних умовах для індукування стеатогепатиту. Протокол може бути використаний для вивчення функцій імунних клітин та вивчення зв’язків специфічних імунних клітин між різними тканинами в мікробіологічно нормалізованому середовищі.
У нашому цьому дослідженні HRFD, що годували мишей, які не є sepF, призводило до розвитку інсулінорезистентності та стеатогепатиту, тоді як у мишей HFD SPF розвивалася інсулінорезистентність, легкий стеатоз печінки, але стеатогепатиту не було, як визначено за допомогою імуногістохімії. Крім того, підгрупи жирової та печінкової плісняви суттєво відрізнялись між мишами, що зазнали впливу HFD та SPF, що підтверджує наше розуміння важливості різних умов життя. На закінчення ми змогли показати, що вплив мікробів на спільноту може суттєво вплинути на імунологічні властивості мишей C57Bl/6. Попередні роботи показали, що на різноманітність та функції кишкового мікробіома впливає ожиріння 19, 20, пов’язане з дієтою, і що функція кишкового бар’єру та проникність кишечника залежать від умов життя 21. У наступній публікації ми хочемо розглянути зв’язок між колонізацією кишечника та запаленням жиру та печінки.
При плануванні запропонованих методів слід враховувати кілька моментів. По-перше, для всіх аналізів проточної цитометрії потрібні одноклітинні суспензії, а на життєздатність клітин може впливати ступінь механічної дисоціації тканин та тривалість перетравлення тканин. Щоб уникнути руйнування ебегітопу антитіл та максимізувати вихід функціонально життєздатних, дисоційованих клітин, слід враховувати тип тканини, вік тварини, генетичні зміни, концентрації ферментів, температуру та час інкубації.
По-друге, наш протокол був оптимізований для кількісної оцінки різних фенотипів ударних клітин від мишей, що годували HFD із ожирінням із запаленням жирової тканини та стеатогепатитом. Оскільки на кількість імунних клітин, кількість імунних клітин і, отже, на якість перетравлення тканин можуть впливати запальні процеси, застосовуваний протокол та колагеназу слід оптимізувати для тканин, відмінних від печінки або жирової тканини, в певних експериментах. Щодо методів дисекції, часу інкубації або колагенази, яка використовується для перетравлення тканини. По-третє, для протоколу важливо, щоби різні експериментальні групи щодня залучалися для того, щоб усунути наслідки щоденних змін в аналізі проточної цитометрії (температура, час інкубації тощо).
Нарешті, ми надаємо детальний протокол фенотипової характеристики мишачого адипозу та імунних клітин печінки з використанням проточної цитометрії на тваринній моделі NASH та резистентності до інсуліну, спричиненої дієтою. Враховуючи складну функцію та регуляцію вроджених та адаптивних клітин, пов’язаних із ожирінням та порушенням регуляції метаболізму, запропоновані нами методи повинні допомогти поглибити наше розуміння імунологічних механізмів для збалансування метаболічного гомеостазу. І тому допоможіть розробити людські терапевтичні засоби, які можуть відновити протизапальну імунну відповідь. Загалом, поставлена на тваринах модель служить швидкою та надійною моделлю для оцінки метаболічних ускладнень, пов’язаних з ожирінням, і може застосовуватися до інших моделей захворювань.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.