В основі генетичних змін в людському зародку - природа - Новини та ідеї
Теми
CRISPR - Технологія редагування генів Cas застосовується в людських ембріонах, вирощених in vitro, для корекції мутації, пов’язаної із захворюванням. Введення редагуючих компонентів у добриво сприяло ефективності ремонту. Див. Статтю с.413
Гіпертрофічна кардіоміопатія є спадковою хворобою серця. Це може бути викликано мутаціями багатьох генів, включаючи серцевий білок, що зв’язує міозин С (MYBPC3). Цей ген кодує білок, який сприяє структурному підтриманню серцевого м’яза та регулюванню його скорочення та розслаблення 4. Наявність мутантної копії MYBPC3 викликає симптоми, які зазвичай проявляються як серцева недостатність. Хоча існуючі методи лікування можуть полегшити симптоми, неможливо усунути основну генетичну причину у пацієнта. Ма та її колеги вивчали використання редагування генів для корекції цієї мутації.
Одним із варіантів запобігання успадковуванню певних станів, пов’язаних з мутацією, є використання генетичних тестів під час лікування фертильності шляхом запліднення in vitro (ЕКО). Це дає можливість відібрати ембріони для імплантації, які не містять конкретної мутації. Якби у одного з батьків, що бере участь у лікуванні ЕКО, була мутантна копія MYBPC3, 50% запліднених ембріонів подружжя успадкували б хворобу. Ма та його колеги пропонують гіпотетичний сценарій, за якого їхній підхід може дозволити людині з гіпертрофічною кардіоміопатією збільшити відсоток ембріонів, доступних для імплантації ЕКО, які не успадкували б захворювання.
За останні кілька років CRISPR - Cas було розроблено 6, 7 для ефективного та точного редагування геному людини. Хоча цей метод був широко прийнятий із використанням систем культури клітин ссавців та моделей ембріонів тварин, лише три опубліковані дослідження 8, 9, 10 повідомляють про використання цієї методики в ембріонах.
Для редагування ДНК CRISPR - Cas Editing System потрібні лише два компоненти: керівна послідовність РНК та фермент нуклеази Cas, причому Cas9 є найбільш часто використовуваним. Конкретна геномна мішень визначається напрямною РНК, яка утворює комплекс з Cas9, дозволяючи ферменту націлюватися на геномний сайт, що містить відповідну послідовність. Тут Cas9 розрізає ДНК, викликаючи дволанцюжковий розрив 6, 7 .
Утворення дволанцюжкових розривів може активувати один з двох основних шляхів відновлення ДНК в клітині: негомологічний шлях кінцевого з'єднання (NHEJ) або шлях відновлення, спрямований на гомологію (HDR). Шлях NHEJ відновлює перерву шляхом випадкового додавання або видалення нуклеотидів, що призводить до змін послідовності ДНК, що робить її непридатною для корекції генів. Тому підходи фокусуються на HDR, який використовує гомологічні послідовності (спарювання) для відновлення розривів ДНК, таким чином дозволяючи вводити конкретні послідовності, щоб забезпечити персоналізований ремонт.
Запланована доставка компонентів CRISPR у відповідну точку циклу поділу клітини, або на переході між фазами G1 та S або між фазами G2 та M, може призвести до переважного використання шляху HDR. На жаль, у попередніх звітах ефективність відновлення жорсткого диска після дії CRISPR - Cas9 була занадто низькою, як у культивованих людських ембріональних стовбурових клітинах (ефективність близько 2%) 11, так і в людських ембріонах (ефективність 14,3-25%) 8 .
Ма та її колеги створили конструкції кріплення генів CRISPR - Cas9 для націлювання на MYBPC3, а також перевірили та проаналізували націлювання генів за допомогою стовбурових клітин людини. Потім вони почали працювати з людськими ембріонами. Однією з головних проблем використання CRISPR - Cas9 для редагування людських ембріональних геномів було явище мозаїцизму, при якому неефективність редагування генів призводить до розвитку ембріона з відредагованими клітинами. Це може призвести до змішування здорових та хворих клітин у різних тканинах та органах, що може спричинити симптоми захворювання.
Повнорозмірне зображення
Ма та ін. досліджував ситуацію, коли у батька була мутантна копія MYBPC3, а у матері були лише копії гена дикого типу. У контрольних експериментах 47,4% (9 із 19) запліднених in vitro запліднених не успадкували мутантну копію MYBPC3, очікувана частка, оскільки половина сперматозоїдів повинна мати незручну копію дикого типу. Автори продемонстрували, що якщо компоненти, що редагують геном, вводили сперму в яйцеклітину людини (ооцит) на стадії клітинного циклу ооцитів, відому як метафаза II (рис. 1б), 72,4% отриманих ембріонів (42 з 58) мав лише дику версію MYBPC3. Решта 16 ембріонів мали копії MYBPC3 з індукованими NHEJ ознаками редагування, які націлені на мутантну версію гена, але не відновили його до дикого типу.
Попередні дослідження щодо CRISPR - редагування випадків в ембріонах людини 8, 9, 10 додали компоненти редагування генів після запліднення. Низький рівень мозаїчності (один із 42 ембріонів з диким типом MYBPC3 був мозаїкою клітин, кожна з яких містить одну з двох версій гена дикого типу), описану Ma et al. може бути результатом модифікації гена до першого поділу клітини.
Відредаговані ембріони розвивались подібно до контрольних ембріонів, причому 50% з них досягли ранньої стадії розвитку, яка називається бластоциста, в якій ембріони містять різні типи клітин. Це вказує на те, що модифікація не блокує розробку.
При ін'єкції монтажних компонентів автори також включили нуклеотидну послідовність, що містить дикий тип MYBPC3, яка може бути використана як шаблон для ремонту монтажним обладнанням. Автори розробили шаблон відновлення для кодування тих самих амінокислот, що і материнська копія гена дикого типу, але використовували різні нуклеотиди, щоб мати можливість розрізнити ремонт, використовуючи або материнську копію MYBPC3, або представлений шаблон відновлення.
Цікаво, що коли автори проаналізували корекцію гена MYBPC3 в ембріонах, вони виявили, що лише один із 42 ембріонів, що містять дикий тип MYBPC3, використовував модель, представлену для репарації. Їх результати вказують на те, що материнська копія дикого типу MYBPC3, швидше за все, надавала шаблон відновлення, а не представлену копію. Це контрастує із спостереженнями авторів у стовбурових клітинах, в яких введений нуклеотидний шаблон був використаний для процесу репарації. Автори припускають, що механізм відновлення ДНК, що діє в ранніх ембріонах, відрізняється від механізму, що існує у стовбурових клітинах. В ембріоні, в якому можна було виявити корекцію за допомогою шаблону відновлення, послідовність шаблонів була знайдена лише в підмножині клітин, а решта клітин цього ембріона, ймовірно, були виправлені з використанням материнської версії гена.
Ще однією перешкодою для використання CRISPR - технології Cas9 є можливість нецільових модифікацій, які можуть відбутися, якщо модифікуючі компоненти зв'язуються з геномними регіонами, демонструючи високу схожість з послідовністю, на яку спрямовано керівництво РНК. Ма та ін. не виявив жодного типу генетичних змін, пов'язаних з нецільовими змінами в копії дикого типу MYBPC3, що передбачає високу точність модифікації.
Були оцінені потенційні нецільові зміни в інших генах. Вражаюче, що нецільовий тест не виявив жодної мутації результатів секвенування ембріональних клітин, що змусило авторів зробити висновок про точність націлювання. Цей висновок є важливим, оскільки нецільові модифікації були описані як проблема використання технології CRISPR у клініці. Однак, оскільки цільові послідовності генів будуть відрізнятися, а варіації також будуть присутні в послідовностях кожного генома, що редагується, ризик нецільових подій може змінюватися в кожному окремому випадку.
Автори дослідили ситуацію, коли одну копію гена потрібно було орієнтувати на редагування, і виявили, що генетичний ремонт покладався на іншу копію гена дикого типу. Однак при деяких захворюваннях як материнські, так і батьківські копії гена є мутантами. У цій ситуації копія дикого типу відсутня, тому стратегія відновлення повинна спиратися на використання введеної послідовності шаблонів. Індукція дволанцюжкових ніків в обох копіях мутантних генів може дозволити використовувати такий шаблон; Однак цілком можливо, що це призведе до більш широкого використання шкідливого шляху NHEJ. У такій ситуації дуже ймовірно, що конкретні стратегії запобігання NHEJ, такі як використання блокуючих агентів, мають вирішальне значення. Ця стратегія також була б корисною навіть тоді, коли має бути націлена на одну копію гена, оскільки 16 з 58 зародків, проаналізованих Ма та її колегами, мали ознаки активності NHEJ. Однак, очевидно, необхідно забезпечити, щоб такі стратегії не призвели до інших шкідливих наслідків для ембріона, що розвивається, та його геному.
Хоча демонстрація Ма та його колег, що цілісність ембріонального геному зберігається після редагування CRISPR - Cas9, є перспективною, будуть потрібні подальші дослідження та оптимізація цієї технології. Їм потрібно буде підтвердити, що підхід є безпечним з точки зору таких критеріїв, як мозаїчність, нецільове редагування та виявлення відхилень в відредагованих ембріонах, перш ніж його можна буде використовувати як лікування спадкових захворювань. Тим не менше, це дослідження відкриває шлях для розслідувань, які можуть призвести до того, що CRISPR - Cas9 в майбутньому потрапить до клініки. До цього часу генетичне тестування ембріонів під час ЕКО залишається стандартним способом запобігання передачі спадкових захворювань в ембріонах людини.