Вивчення короткочасних наслідків збільшення споживання алкоголю та сигарет на
предметів
реферат
вступ
Безпліддя зачіпає близько 15% пар, які намагаються завагітніти, і в половині цих випадків причина пов'язана з репродуктивними проблемами чоловіків 1. Великий відсоток випадків безпліддя у чоловіків є ідіопатичними (
У Португалії зросло споживання алкоголю серед людей старше 15 років (у середньому 12,9 літра/особа/рік) 14, тоді як близько 32,4% португальців старше 15 років курили. Існує сильна традиція гострого зловживання алкоголем, сигаретами та наркотиками під час португальських академічних святкувань. Це забезпечує виняткові умови для вивчення цієї проблеми, оскільки велика кількість молодих чоловіків добровільно піддаються впливу високих рівнів шкідливих факторів протягом чітко визначеного та обмеженого періоду часу, які мали відносно здоровий спосіб життя до та після контакту.
Метою цього дослідження було вивчити ранні та пізні короткочасні наслідки гострих змін способу життя, особливо вживання алкоголю та сигарет, на основні параметри сперми та окисного балансу людини. Зважаючи на важливість насінної плазми для дозрівання, живлення та захисту сперми, також оцінювали функцію придатка яєчка та вторинних залоз.
Методи
Дизайн дослідження та учасники
Вплив кількох факторів способу життя на якість сперми досліджували у зразках здорових молодих добровольців чоловічої статі репродуктивного віку у три точно визначені моменти: раніше (момент часу 1 - TP1), тиждень (момент часу 2 - TP2) та три місяці (момент часу 3 - TP3) після португальських академічних урочистостей (7-денний захід), де зловживання алкоголем, сигаретами та наркотиками є традицією (рис. 1). Враховувались лише ті добровольці, які надали зразок у всіх трьох ТП.
Невимірена смута, що зустрічається під час академічних урочистостей, включає такі фактори, як дієта та зміна циркадного ритму. TP, моменти часу.
Дослідження рекламували в університетському містечку Авейру, і добровольцями приймали лише студентів цього університету. В рекламі чітко вказані гіпотеза та основні цілі дослідження, і фінансова компенсація не застосовувалася. Усі учасники отримували чіткі письмові вказівки щодо відбору зразків та відповідали на анкету з допоміжним виконанням кожного разу, коли брали пробу. Анкети містили питання щодо тривалості утримання, попередніх/недавніх захворювань, вживання наркотиків та алкоголю, вживання сигарет та наркотиків (таких як конопель та кокаїн). Параметр споживання алкоголю визначався як розрахункова загальна кількість алкоголю (у грамах). У SP1 та SP3 цей параметр враховував споживання алкоголю на тиждень за місяць до академічних урочистостей. TP2 відображав споживання алкоголю протягом навчального тижня фестивалю. Параметр споживання сигарет визначався як розрахункова загальна кількість нікотину (у міліграмах). У SP1 та SP3 цей параметр враховував тижневе споживання нікотину за місяць до академічних урочистостей. TP2 відображав споживання нікотину під час академічного фестивального тижня. Усі дані були анонімізовані.
Етичне визнання
Це дослідження було схвалено Комітетом з питань етики та внутрішнього контролю лікарні Інфанте Д. Педро EPE, Авейру, Португалія (номер процесу: 36/AO) та проведено відповідно до етичних стандартів Гельсінкської декларації. Усі учасники отримали чіткі письмові вказівки щодо проекту дослідження та підписали декларацію про згоду, що дозволяє використовувати зразки в наукових цілях.
Забір сперми, базовий аналіз сперми та підготовка сперми
Зразки сперми отримували мастурбацією у стерильному контейнері та доставляли протягом 30 хвилин для базового аналізу сперми. Усі зразки були проаналізовані досвідченими техніками згідно з критеріями Всесвітньої організації охорони здоров'я 15. Коротше кажучи, після того, як зразки сперми були повністю зріджені при температурі 37 ° C протягом приблизно 30 хвилин, було проведено макроскопічне дослідження. Мікроскопічне дослідження включало аналіз рухливості, концентрації та морфології сперми. Всі мікроскопічні аналізи проводили за допомогою мікроскопа Zeiss Primo Star (Carl Zeiss AG, Німеччина). Зразки сперми тричі промивали в PBS. Насінну плазму збирали з першого промивання і використовували для подальшого тестування. Екстракти сперми ресуспендували в 1% SDS. Концентрацію білка вимірювали за допомогою аналізу біцинхонової кислоти (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, США), а кінцеву абсорбцію вимірювали при 562 нм в мікропланшеті (серія Infinite® 200 PRO, Tecan Trading AG, Швейцарія).
Вестерн-блот-аналіз експресії антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази 1 (SOD1) та глутатіонпероксидази 4 (GPx4)
Екстракти сперматозоїдів обробляли ультразвуком, кип’ятили і рівну кількість білка (50 мкг) завантажували в 10% гель SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Імунодетекцію проводили з використанням мишачого анти-SOD1, 1: 1000 (MABC864, Merck Milipore, Дармштадт, Німеччина) та кролячого анти-GPx4 (ABC269, Merck Milipore, Дармштадт, Німеччина) з подальшою інкубацією з відповідним інфрачервоним випромінюванням -Вторинні антитіла (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Кембридж, Великобританія). В якості контролю завантаження використовували бета-тубулін (Merck Milipore, Дармштадт, Німеччина). Мембрану сканували за допомогою системи інфрачервоного зображення Odyssey (LI-COR Biosciences, Кембридж, Великобританія).
Визначення карбонільної групи (CG) за допомогою прорізного промокання
Екстракти сперматозоїдів, що містять 30 мкг білка, дериватизували 20 мМ 2,4-динітрофенілгідразином, розчиненим у 10% трифтороцтовій кислоті, та нейтралізували 1,5 об'ємними частинами 2 М трис з 18% меркаптоетанолом. Для проведення промокання прорізів зразок розбавляли до 0,002 мкг/мкл і вводили в нітроцелюлозну мембрану в пристрої прорізування прорізів (BioRad Portugal, Sintra, Portugal). Мембрану інкубували з кролячим анти-ДНП, 1: 5000 (MAB2223, Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина), потім інфрачервоним вторинним антитілом проти кроликів (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, Великобританія). Виявлення проводилося в системі інфрачервоного зображення Odyssey (LI-COR Biosciences, Кембридж, Великобританія).
Визначення 3-нітротирозину (3-NT) у спермі методом промокання щілинами
Екстракти сперматозоїдів знаходились у 1xTBS до кінцевої концентрації 1? г/мкм л розведений. Зразки наносили на нітроцелюлозну мембрану в прорізному блоті (BioRad Portugal, Sintra, Portugal). Потім мембрану покрили кролячим антинітротирозином, 1: 1000 (DAM1514077, Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина), а потім вторинним антитілом проти кроликів (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd, Кембридж, Великобританія) інкубували. Виявлення було проведено в системі інфрачервоного зображення Odyssey (LI-COR Biosciences UK Ltd., Кембридж, Великобританія).
Загальний антиоксидантний статус (TAS)
Концентрацію антиоксидантів у сперматозоїдах вимірювали за допомогою аналізу загального антиоксидантного статусу (TAS) (NX2332, Randox Laboratories, Crumlin, Північна Ірландія). Протокол, наданий виробником, був змінений з метою використання мікропланшета (зменшено кількість реагентів та проб).
Біохімічний аналіз маркерів епідидимальної та допоміжної статевих залоз
Біохімічні маркери функції придатків яєчка (нейтральна α-глюкозидаза, NAG), функції простати (лимонна кислота) та функції насінних бульбашок (фруктоза) оцінювали в насінній плазмі. Загальну активність NAG вимірювали за допомогою комерційно доступного набору аналізу α-глюкозидази EpiScreen Plus (FertiPro, Beernem, Бельгія) згідно з інструкціями виробника. Для кількісної оцінки кількості фруктози в насінній плазмі використовували тест на фруктозу (FertiPro, Beernem, Бельгія) відповідно до інструкцій виробника. Вміст лимонної кислоти в насінній плазмі вимірювали за допомогою тесту на лимонну кислоту (FertiPro, Beernem, Бельгія) відповідно до інструкцій виробника.
Статистичний аналіз
Результати
Всього в це дослідження було включено 36 здорових кавказьких студентів-чоловіків середнього віку 22 ± 3 років. Жодної попередньої вагітності, супутніх медичних захворювань, вживання ліків або наркотиків серед учасників набору даних не зафіксовано. Описовий аналіз результатів представлений у таблиці 1. Нижче описані лише статистично значущі результати (рис. 2, таблиця 2). Усі попарні відмінності між часом дослідження (ТП) описані в додатковій таблиці S1.
Скринька з алкоголем ( А. ) та споживання нікотину ( B. ), основний параметр сперми ( C. - К ), маркер окисного стресу ( Л. ) та функція придатка яєчка ( М. ) та додаткові статеві залози ( і О ) в різні моменти часу (TP). Значення Р з тестів із парними зразками зведені в таблицю 2.
Вплив академічних урочистостей на основні параметри сперми та маркери окисного стресу сперми
Споживання алкоголю на день зросло більш ніж у вісім разів між TP1 і TP2. У ТР3 рівень споживання алкоголю впав до базових значень (ТР1) (рис. 2А; табл. 2). У TP2 споживання нікотину значно зросло порівняно з TP1 (у 2 рази) (2B; Таблиця 2).
Спостерігались відмінності в основних параметрах насіння (рис. 2С-К; табл. 2). Обсяг сперми продемонстрував значне зменшення порівняно з ТП (18% від TP1 до TP2; 19% від TP2 до TP3; 33% від TP1 до TP3) (рис. 2С, таблиця 2). Концентрація сперми та загальна кількість сперми в еякуляті значно зменшились з TP1 до TP3 (20% та 52% відповідно) (2D та E; Таблиця 2). Відсоток прогресуючої моторики зменшився з TP1 до TP2 (15%) (рис. 2F; таблиця 2). Відсоток непрогресуючих рухомих сперматозоїдів збільшився над ТР (40% від TP1 до TP2; 50% від TP1 до TP3) (ФІГ. 2G; Таблиця 2). Відсоток нерухомих сперматозоїдів значно зменшився з ТР1 на ТР2 (14%) (ФІГ. 2Н; Таблиця 2). Що стосується морфології сперми, відсоток нормальної сперми був значно вищим у ТР1 порівняно з ТР2 та ТР3 (Фіг. 2I; Таблиця 2). Зокрема, похибки головки та центральної частини були вищими у TP2, ніж у TP1 та TP3 (рис. 2J та K; таблиця 2).
Рівень 3-нітротирозину (3NT) у спермі був єдиним маркером окисного стресу, який продемонстрував значні зміни (рис. 2L; таблиця 2). У ТР2 рівні залишків тирозину, які страждають від нітрування, були в 1,4 рази вищими, ніж у ТР3.
Вплив академічних урочистостей на функцію придатка яєчка та допоміжних статевих залоз
Відмічено значне зниження активності нейтральної α-глюкозидази (NAG) в еякуляті з TP1 до TP3 (46%) і з TP2 до TP3 (35%) (ФІГ. 2М; Таблиця 2). Що стосується загальної кількості фруктози в еякуляті, також спостерігалося значне зниження з TP1 до TP3 (28%) та з TP2 до TP3 (23%) (2N; Таблиця 2). Загальна кількість лимонної кислоти в еякуляті була значно нижчою в ТР3 порівняно з ТР1 (36%) (2О; Таблиця 2).
обговорення
Різні фактори способу життя пов’язані з репродуктивними проблемами чоловіків 5, 6, 16, 17. Однак дослідження щодо впливу токсичних речовин на сперму є суперечливими і часто упередженими 5, 18, 19. Для подолання цих проблем академічні урочистості використовувались як модель дослідження, оскільки протягом 7 днів одночасно відбувалися численні зміни способу життя (рис. 1). Ця модель забезпечує виняткові умови для вивчення наслідків гострих змін способу життя на молоде та здорове населення.
Наше дослідження показує, що гостре споживання алкоголю та сигарет, поряд з іншими жорстокими способами поведінки, яким волонтери піддавались протягом навчального тижня, спричинило значний короткочасний вплив на якість сперми на ранніх (SP2) та пізніх (SP3) (малюнки 2 та 3). . Як очікувалось, споживання алкоголю та сигарет зросло під час академічних урочистостей порівняно з рівнями, що спостерігались за тиждень до та за три місяці після академічних урочистостей (рис. 2). Ця раптова зміна способу життя була пов’язана зі шкідливими наслідками для якості сперми як рано, так і пізно. Об’єм сперми, концентрація сперми, загальна кількість сперматозоїдів, прогресуюча рухливість та нормальна морфологія зменшувались разом із активністю NAG та кількістю фруктози та лимонної кислоти в еякуляті. Крім того, був збільшений відсоток непрогресуючої та нерухомої сперми разом із значеннями нітрування білка (рис. 2 та 3).
Повідомлялося, що хронічне вживання алкоголю та сигарет може призвести до порушення роботи допоміжних залоз 20, 21. Отримані нами результати свідчать про те, що гострі зміни способу життя короткочасно негативно впливають на функцію придатка яєчка та допоміжних статевих залоз, що також відображається у зменшенні обсягу сперми в ТП.
Це дослідження також показує, що гострі зміни способу життя, головним чином через збільшення споживання алкоголю та сигарет, мають значний вплив на морфологію сперми. Через тиждень (ТР2) та 3 місяці (ТР3) після гострих змін способу життя спостерігали збільшену кількість дефектів головки та середнього відділу та зменшення частки морфологічно нормальних сперматозоїдів, що свідчить про вплив на морфологічно зрілі сперматозоїди в придатку яєчка та на формування сперматозоїдів у яєчках може закрити (рис. 2). Одне дослідження показало, що дуже мало алкоголіків-чоловіків є нормозооспермічними, що посилює шкідливий вплив алкоголю на морфологію сперми 5. Як концентрація сперматозоїдів, так і відсоток морфологічно нормальних сперматозоїдів зменшилися через 3 місяці після академічних урочистостей, що свідчить про порушення процесу сперматогенезу.
Дійсність дослідження обмежена відносно невеликим загальним обсягом вибірки та ризиком неправильної класифікації через використання ретроспективної інформації про вплив алкоголю, сигарет та наркотиків. Необхідно також брати до уваги відхилення відбору, оскільки всі добровольці були кавказькими. Крім того, ми не можемо виключити, що наші результати зумовлені незміряними незрозумілими факторами, включаючи дієту, зміни циркадного ритму, фізичні вправи та стрес.
Через звичну поведінку населення на академічних урочистостях було дуже важко набирати предметів, які не змінили свій спосіб життя в ТП2. Насправді лише 2 людини у нашій вибірці відповідають цьому критерію. Однак можна помітити, що загальна тенденція результатів свідчить про те, що зміни способу життя негативно впливають на якість сперми. Якби результати були зумовлені природними відмінностями в аналізі сперми, можна було б очікувати випадкову закономірність змін.
Мінімальний обсяг вибірки не розраховувався через відсутність інформації про сукупність. Однак розмір набору даних вважався доцільним, оскільки центральна гранична теорема дозволяла розподілу змінних наближатись до нормального розподілу.
Це дослідження сприяло кращому розумінню патофізіології, що лежить в основі погіршення якості сперми, спричиненої гострими змінами способу життя. Це свідчить про те, що особливо високе споживання алкоголю та сигарет пов’язане зі зниженням якості сперми у здорових молодих чоловіків та згубно впливає на всі параметри сперми. Збільшення окисного стресу на сперму та порушення функції придатків яєчка та допоміжних статевих залоз. Тому здоровим чоловікам можна порадити, що періодичні гострі зміни способу життя короткочасно погіршують їх фертильність. Потрібні додаткові дослідження, щоб зрозуміти, чи відновлюється якість сперми, чи гострі зміни способу життя мають довгострокові наслідки.
Додаткова інформація
Як цитувати цю статтю: Vieira Silva, J. et al. Вивчення короткочасних наслідків збільшення споживання алкоголю та сигарет на якість сперми здорових молодих чоловіків. Наук. Респ. 7-й, 45457; doi: 10, 1038/srep45457 (2017).
Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо претензій щодо юрисдикції в опублікованих картах та інституційних зв'язках.
Додаткова інформація
Файли PDF
Додаткова таблиця S1
Зауваження
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь з нашими умовами використання та правилами спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.