Залізозалежна позапечінкова регуляція гепсидину - PDF Безкоштовно завантажити
1 Університетська лікарня Ульм Центр внутрішньої медицини Клініка внутрішніх хвороб I Медичний директор: Проф. мед. Thomas Seufferlein Залізозалежна позапечінкова регуляція гепсидину Дисертація На здобуття докторської ступеня з стоматології медичного факультету Ульмського університету, представленої Кларою Рут Фрідою Бреніг з Мюнхена 2013 р.
2 в.о. декана: проф. Томас Вірт 1-й репортер: PD Dr. Павло Стрнад 2. Доповідач: проф. День просування Ларса Буллінджера:
4 Зміст Зміст Зміст малюнків Перелік таблиць Перелік абревіатур III V VI 1 Вступ Баланс заліза Вираз і структура гепсидину Механізми дії гепсидину Регуляція печінкового гепсидину Гепсидин у позапечінкових органах Мета дослідницької роботи Матеріал та методи Матеріал Хімікати Реакційні суміші та буферні розчини Набори Пристрої Методи Тваринництво Експериментальний набір тварин Експериментальний набір Експериментальний набір тварин Експериментальний набір Експериментальний набір тварин Експериментальний набір Експериментальний набір тварин Експериментальний набір Експериментальний набір тварин Експериментальний набір Експериментальний набір РНК із синтезу першої ланцюга кДНК тканини Кількісне визначення ПЛР у реальному часі Визначення заліза в тканині Виділення білка з тканини Визначення білка Вестерн-блот Гістологія та фарбування Визначення ферритину та сироваткового заліза в сироватці
5 Зміст 3 Результати Концентрація заліза та сироваткового феритину після дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на печінку Концентрація печінки в печінці Вплив дієти з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на позапечінкові органи Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на селезінку Дієта з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на шлунок Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на підшлункову залозу Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на нирки Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на дванадцятипалу кишку Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на серце Обговорення Системні параметри заліза залежно від вмісту заліза в дієті, що вводиться Місцева концентрація заліза в позапечінкових органах залежно від вмісту заліза в їжі, що вводиться Гепсидинові експресії позапечінкових органів залежно від дієти, що вводиться Анотація 53 Посилання покажчик 54 Подяка 63 Резюме 64 II
8 Список таблиць Список таблиць Таблиця.1 Послідовності праймерів для аналізу RT-PCR Таблиця.2 Стандартний розчин заліза Таблиця.3 Схема піпетування для приготування гелю трицину-SDS-поліакриламіду 22 Таблиця 4 Первинні антитіла Таблиця 5 Вторинні антитіла V
9 Список скорочень Список скорочень µ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNA dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl activin-like receptor-like Kinase2/3 персульфат амонію амінокислота кісткового морфогенетичного білка (рецептора) Bathophenanthrolinedisulfonic кислоти динатрієвої солі теляча сироватка Альбумін комплементарної ДНК Дистильована Desferroxamine двовалентного металу Carrier1 дезоксирибонуклеїнової кислоти дезокси-нуклеозидтрифосфат дітіотреїтолу Enhanced Водно-Aemrotein680/Glycuclee-130 Білок Hepaferonemia-hepatone-80/Glycucleide-130-Glycocytes Pamma Рецептор) Молярний нанохлорид натрію VI
10 Список скорочень p ПЛР psmad qrt РНК об/хв SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Піко Полімеразна ланцюгова реакція Фосфорильований SMAD Кількісне кількість рибонуклеїнових кислот в реальному часі в хвилину Додецилсульфат натрію Сульфат м'язової атрофії та перебігу хвороби головного мозку, N, N, N -Тетраметилетилендіамін 1,2-біс (диметиламіно) -етан-трансферин (рецептор) Трансформуючий фактор росту Трис- (гідроксиметил) -амінометан Вольт VII
19 1 Вступ Органи, однак, в основному ще не досліджені. Досі різні дослідження показали, що різні фактори, такі як Перевантаження залізом, запалення або гіпоксія можуть впливати на місцеву експресію гепсидину в непечінкових органах, але механізм, як правило, залишається незрозумілим. З метою покращення розуміння регуляції позапечінкового гепсидину в цій дослідницькій роботі проаналізовано вплив перевантаження заліза або його дефіциту на баланс заліза та експресію гепсидину в різних тканинах. Для цього мишей дикого типу використовували як зразкову систему та годували різними залізними дієтами. Потім вплив цих дієт на експресію гепсидину досліджували на рівні РНК та білка. Крім того, вимірювали концентрацію заліза в тканинах. 9
20 2 Матеріали та методи 2 Матеріали та методи Усі хімічні речовини, реагенти, набори, матеріали та пристрої, що використовуються у цій роботі, перелічені у наступних списках. 2.1 Матеріал Хімічні речовини Акриламід APS (персульфат амонію) L-аскорбінова кислота β-меркаптоетанол Батофенантролін дисульфокислота динатрієва сіль (BPS) Бісакриламід Бичачий сироватковий альбумін (BSA) Бредфордівський реагент Бромофенол синій Coomassie синій дезоксинуклеотипсульфоксид трифторметилсульфоксид міксофтоксид Дітіотрейтол (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Біо Рад, Laboratories Gmbh, Мюнхен Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Carl Roth GmbH + CO. KG, Карлсруе Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg BIO-RAD Laboratories GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен BIO-RAD Laboratories GmbH, Мюнхен PeqLab, Erlangen MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Бакінгемшир, Великобританія 10
21 2 Матеріал та методи Негідрат заліза III Нітрат Нітрат заліза Карбонат Розробник Еозин Етанол Фіксуючий розчин Формальдегід Гліцерин Гліцин Гематоксилін Ізопропанол Калій Гексаціаноферрат Хлорид II Ядерний Швидкий Червоний Метанол Новекс гострий білок Оліго (dT) 20-праймер-інгібітор протеїнази RNA Green-ROX Green-Mini-ROX-RBR Green-Mini RN-Green Green Master Mix SuperScriptIII Зворотна транскриптаза Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Дармштадт Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Tetenal AG & Co KG, Norderstedt Sigma Aldrich Chemie GmbH + Мюнхен Carl Ко KG, Карлсруе Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруе Мерк KGaA, Дармштадт Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Merck, Дармштадт Vector Laboratories, Берлінгейм, США Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Dako Deutschland GmbH, Hamburg Invitrogen, Дармштадт Рош, Мангейм Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH Hilden Invitrogen GmbH, Дармштадт, 11
22 2 Матеріал і методи Соляна кислота ТЕМЕД (N, N, N, N -Тетраметил-етилендіамін) Трис- (гідроксиметил) - амінометан Твін20 Ксилол Моногідрат лимонної кислоти VWR International GmbH, Дармштадт Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен VWR, Ульм Мерк KGaA, Дармштадт 12
23 2 Матеріал та методи Реакційні партії та буферні розчини Аскорбінова кислота Анодний буфер Змішувальний буфер BPS Кумасі Синій розчин Дназна суміш Екстракційний буфер Робочий розчин для фарбування заліза Буфер для завантаження гелю (5x) 0,088 г аскорбінової кислоти 5 мл H 2 O 24,22 г Tris ad 1L H 2 O 3,03 г Tris 11,26 г гліцину 100 мл метанолу і 1 л дист. H 2 O ph 8,3 14,76 мг BPS 5 мл H 2 O 400 мл метанолу 100 мл етанової кислоти 0,4 г Coomassie blue 250 г до 1 л дист. H 2 O 70 мкл RDD 10 мкл ДНаза/зразок 10 мМ Трис 0,5% Тритон Х-100 ph 7,5 100 мл 2% гексаціаноферрат калію II 100 мл 1% HCl 1М Трис 10% SDS 50% гліцерин 25% β меркаптоетанол бромофенол синій 375 мкл розст. H 2 O ph 6,8 13
24 2 Матеріал та методи Укладання гелевого буфера Катодний буфер Стандартний розчин для визначення заліза Розділювальний гелевий буфер T40/C3 T40/C6 Трис-буферний сольовий розчин (TBS) Трис-буферизований фізіологічний розчин з буфером Tween (TBST) RLT + β ME основна суміш для синтезу кДНК I 60, 5г Трис до 1л дист. H 2 O ph 6,8 12,11 г Трис 17,92 г Трицин 10 мл SDS ad 1L H 2 O 0,003607 г Нітрат заліза III Неагідрат 1 мл H 2 O 1811,71 г Трис ad 1L розх. H 2 O ph 8,8 7,76 г акриламіду 0,24 г бісакриламіду до 20 мл VE-H 2 O 18,8 г акриламіду 1,2 г бісакриламіду до 50 мл VE H 2 O 8,76 г NaCl 1,21 г Tris ad 1L дист. H 2 O ph 7,5 1 л TBS 1 мл Твін20 10 мкл 1% β меркаптоетанолу 1 мл RLT (частина RNeasy Mini Kit) 1 мкл оліго (dT) 20 праймер (0,2 мкг/мкл) РНК (2 мкг) 1 мкл dntp-суміші (10 мМ кожна ) ad 14 мкл води без РНКази 14
25 2 Матеріал та методи Master-Mix для синтезу кДНК II Master-Mix для RT-PCR Primermix Лимонна кислота 4 мкл Буфер першої нитки 1 мкл 0,1 М DTT 1 мкл SuperScriptIII RT (200 МО/мкл) 5 мкл SYBR-Mix 3 мкл H 2 O дест . 0,03 мкл початкового праймера (100 пмоль) 0,03 мкл заднього праймера (100 пмоль) на 1 мкл H 2 O дист. 1,05 г моногідрату лимонної кислоти 50 мл H 2 O набори RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden включає: RDD-буфер першого ланцюга (буфер без RNase) RNeasy буфер для лізису RLT Rnase-free DNase RW1 RPE пристрої 7500 Fast Real-Time PCR System with Програмне забезпечення: Виявлення послідовності версія 1.5 KC4 Програмне забезпечення для аналізу даних Програмне забезпечення Аналітичний баланс Applied Biosystems, Дармштадт BioTek, Бад-Фрідріхшалл Сарторіус AG, Геттінген 15
37 3 результати контрольної дієти майже не були знижені (86,9 ± 24 мкг/г у групі, бідній залізом, 105,2 ± 22,6 мкг/г у контрольній групі. Див. Малюнок 6). Концентрація заліза в печінковій тканині групи, що багата залізом, була в 5 разів вищою, ніж у контрольної дієти (589,4 ± 243 мкг/г у групі, що багата залізом). Рисунок 5: Гістологічне дослідження печінки мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартною і багатою на залізо. Тканина печінки, забарвлена в берлінські сині забарвлення, показує в тканині (А) мишей, яких годували кормом з низьким вмістом заліза, в (В) - стандартним кормом і в (С) годували багатою залізом їжею. У мишей, яких годували багатою залізом дієтою, можна спостерігати значне перипортальне накопичення заліза (стрілка). Збільшення: 20-кратна концентрація заліза (мкг/г) p = 0, EA ST ER Рисунок 6: Концентрація заліза в печінковій тканині мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартна і багата залізом Концентрація заліза в печінці мишей через 5 тижнів з низьким вмістом заліза (ЕА), стандартна ( ST) та 4-тижнева дієта, багата залізом (ER). Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу Експресія печінкового гепсидину Експресія гепсидину1 та гепсидину2 у мишей, що харчуються бідними залізом, була значно знижена порівняно з контрольною дієтою (гепсидин1: р = 0,001; гецидин2: 27
40 3 Результати 400 Концентрація заліза (мкг/г) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER Рисунок 9: Концентрація заліза в тканині селезінки мишей після бідної залізом стандартної та багатої залізом дієти Концентрація заліза в селезінці мишей через 5 тижнів бідної залізом (EA), стандартна (ST) та дієта, багата залізом (ER) на 4 тижні. Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу. AB 6 5 Експресія гепсидину1 щодо ß-актину p = 0,03 p = 0,05 Експресія гепсидину2 щодо ß-актину EA ST ER 0 EA ST ER Рисунок 10: Експресія гепсидину мрна в селезінці у мишей з низьким рівнем заліза, Стандартна і багата залізом дієта (A) Гепсидин1 та (B) Експресія гепсидину2 щодо експресії β-актину в селезінці у мишей після дієти, бідної залізом (EA), стандартної дієти (ST) та дієти, багатої залізом (ER), кількісно оціненої RT -PCR. Результати повідомляються як засіб принаймні 5 мишей на групу ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 30-й
42 3 Результати A B C Рисунок 12: Гістологічне дослідження тканин шлунка мишей з низьким вмістом заліза, стандартним і багатим залізом дієтичним фарбуванням корпусу тіла у мишей (A) після годування з низьким вмістом заліза, (B) контрольна група, (C) група, багата залізом. Зразкові накопичення заліза в основних клітинах контрольної дієти та збагаченої залізом дієти позначені стрілкою. Збільшення: 20 разів. проведено аналіз кляксів і кількісну RT-PCR. При аналізі білка антитіла проти STAT3 та активна форма STAT3, pstat3, показали смугу при 70 кДа (див. Малюнок 15). Однак через постійну інтенсивність смуги, розслідування не виявило жодних доказів збільшення виробництва STAT3. Крім того, експресію IL-6 вимірювали за допомогою кількісної RT-PCR. Через надзвичайно низький рівень експресії було показано, що запалення не було (2,3 ± 1,6 у групі, бідній залізом, 1 ± 0,5 у контрольній групі, 2,4 у групі, багатій залізом, див. Малюнок 16). 32
43 3 Результати 600 Концентрація заліза (мкг/г) p = 0,007 0 EA ST ER Рисунок 13: Зміна концентрації заліза в корпусі мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартна і багата залізом Концентрація заліза в корпусі мишей через 5 тижнів низького вмісту заліза (ЕА), стандартна - (ST) та 4-тижнева дієта, багата залізом (ER). Миші, яким давали стандартну чау, служили контролем. Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу. AB 20 1,5 Експресія гепсидину1 щодо ß-актину p = 0,03 Експресія гепсидину2 щодо ß-актину 1 0,5 p = 0,04 0 EA ST ER 0 EA ST ER Рисунок 14: експресія mrna im Корпус мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартної та багатою на залізо дієти (A) Гепсидин1 та (B) Гепсидин2 відносно експресії β-актину в тілі у мишей після дієти з низьким вмістом заліза (EA), стандартної дієти (ST) та дієти з високим вмістом заліза (ER) кількісно визначається за допомогою RT-PCR. Результати повідомляються як середнє значення ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 33
44 3 Результати Низький рівень заліза в крові із високим вмістом заліза Печінка PosKont pstat3 STAT3 ß-тубулін Рисунок 15: Експресія білка STAT3/pSTAT3 у мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартної та багатої залізом Вестерн-блот-аналіз тканини шлунку мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартної та багатою на залізо. Антитіла: pstat3 (перетворювачі фосфосигналу та активатор транскрипційного білка), STAT3 (перетворювачі сигналів та активатор транскрипційного білка). Печінка PosKont відповідає позитивному контролю печінки. β-тубулін використовували як контроль навантаження. 5 Експресія IL-6 щодо ß-актину p = 0,01 0 EA ST ER Рисунок 16: Експресія mrna у корпусі мишей після експресії інтерлейкіну-6 (IL-6) із низьким вмістом заліза в організмі, порівняно з β-актином Експресія в тілі у мишей після дієти з низьким вмістом заліза (ЕА), стандартної дієти (СТ) та дієти з високим вмістом заліза (ЕР), кількісно оцінена методом RT-PCR. Результати повідомляються як засіб принаймні 5 мишей на групу ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 34
46 3 Результати 25 Концентрація заліза [! G/g] EA ST ER Рисунок 18: Концентрація заліза в підшлунковій залозі мишей після низького вмісту заліза, стандартного та багатого залізом дієти Концентрація заліза в підшлунковій залозі мишей після 5 тижнів низького рівня заліза (EA), стандарту (ST) та 4-тижнева дієта, багата залізом (ЕР). Миші, яким давали стандартну чау, служили контролем. Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу. AB 2 2 Експресія гепсидину1 щодо ß-актину 1 Експресія гепсидину2 щодо ß-актину 1 p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER Рисунок 19: Експресія мрна панкреатичної залози у мишей з бідним залізом, стандартним та багатим на залізо Дієта (A) експресія гепсидину1 та (B) гепсидину2 щодо експресії β-актину в підшлунковій залозі у мишей після дієти, бідної залізом (EA), стандартної дієти (ST) та дієти, багатої на залізо (ER), кількісно оціненої за допомогою RT-PCR. Результати повідомляються як засіб принаймні 5 мишей на групу ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 36
48 3 Результати 300 Концентрація заліза [! G/g] EA ST ER Рисунок 21: Концентрація заліза в нирках мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартна і багата залізом Концентрація заліза в нирках мишей після 5 тижнів низького вмісту заліза (EA), стандартна (ST ) і 4-тижнева дієта, багата залізом (ER). Миші, яким давали стандартну чау, служили контролем. Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу. Експресія гепсидину1 відносно ß-актину Експресія гепсидину2 відносна ß-актину EA ST ER 0 EA ST ER Рисунок 22: Експресія гепсидину мрна нирок у мишей після бідної залізом, стандартної та багатої на залізо дієти (A) Гепсидин1 та (B ) Експресія гепсидину2 щодо експресії β-актину в нирках у мишей після дієти, бідної залізом (EA), стандартної дієти (ST) та дієти, багатої залізом (ER), кількісно оціненої за допомогою RT-PCR. Результати повідомляються як засіб принаймні 5 мишей на групу ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 38
50 3 результати 400 Концентрація заліза [! G/g] p = 0, EA ST ER Рисунок 24: Концентрація заліза в дванадцятипалій кишці у мишей після низького вмісту заліза, стандартна і багата залізом дієта Концентрація заліза в дванадцятипалій кишці мишей через 5 тижнів низького рівня заліза (ЕА) (ST) та дієта, багата залізом (ER) на 4 тижні. Миші, яким давали стандартний корм, служили контролем. Наведені середні значення принаймні 5 мишей на групу. AB 4 2 Експресія гепсидину1 відносно ß-актину Експресія гепсидину2 щодо ß-актину 1 0 EA ST ER 0 EA ST ER Рисунок 25: Експресія гепсидину mrna в дванадцятипалій кишці у мишей після бідної залізом, стандартної та багатої на залізо дієти (A) Експресія гепсидину1 та (B) Гепсидину2 щодо експресії β-актину в дванадцятипалій кишці у мишей після дієти, бідної залізом (EA), стандартної дієти (ST) та дієти, багатої на залізо (ER), кількісно оціненої за допомогою RT-PCR. Результати повідомляються як засіб принаймні 5 мишей на групу ± стандартне відхилення. Значення - це відносні значення, які були нормалізовані щодо контролю (= 1). 40
51 3 Результати Вплив дієт з низьким вмістом заліза та високим вмістом заліза на серце У серці не виявлено гістологічних змін чи скупчень заліза (див. Малюнок 26). Концентрація заліза в серці відповідає 10% від концентрації заліза в печінці. Зміни між дієтою з низьким вмістом заліза та контрольною дієтою не помітні, однак існує тенденція до збільшення концентрації у дієті з високим вмістом заліза (8,5 ± 12,0 мкг/г у групі з низьким вмістом заліза, 3,1 ± 5,7 мкг/г у контрольній групі, 25,7 ± 22,9 мкг/г у групі, багатій залізом, див. Малюнок 27). Крім того, рівні експресії гепсидину в серці також не виявили змін (Гепсидин1: 1,5 ± 0,8 у групі, бідній залізом, 1 ± 0,7 у контрольній групі, 2,5 ± 1,4 у групі, багатій залізом; Гепсидин2: 1,2 ± 0,3 у групі, бідній залізом, 1 ± 0,1 у контрольній групі, 1,3 ± 0,3 у групі, багатій залізом). Див. Малюнок 28. ABC Рисунок 26: Гістологічне дослідження серця мишей після дієти з низьким вмістом заліза, стандартною і багатою на залізо Берлінським синім фарбуванням у серці мишей після (А) годування з низьким вмістом заліза, (В) стандартного годування та (С) годування багатим залізом . Збільшення: 20 разів. 41