Додаток - Розпорядження від 21 травня 1986 року щодо офіційного методу; аналіз на вітамін С
Останнє оновлення даних для цього тексту: 06 липня 1986 р
- Згорнути додатки (стаття додатка)
- Розгортається Офіційний метод визначення вітаміну С (L-аскорбінова та дегідро L-аскорбінова кислоти) в дієтичних та дієтичних продуктах (флуориметричний метод). (Стаття у додатку)
Додаток
1. Визначення та сфера застосування.
Вміст вітаміну С (L-аскорбінова та дегідроL-аскорбінова кислоти) у дієтичних та дієтичних продуктах є результатом, отриманим із застосуванням методу, описаного нижче.
Окислення L-аскорбінової кислоти до дегідро L-аскорбінової кислоти за допомогою активованого вугілля (нориту). Реакція дегідроЛ-аскорбінової кислоти, що утворюється з ортофенілендіаміном, і утворення флуоресцентної сполуки, що має максимум збудження при 350 нм і максимум випромінювання при 425 нм. Інтенсивність випромінювання флуоресценції пропорційна концентрації вітаміну С у зразку.
Усунення паразитичної флуоресценції із зразка:
додавання борної кислоти до так званого контрольного зразка (дегідроЛ-аскорбінова кислота комплексує з борною кислотою і більше не реагує з ортофенілендіаміном). Відніміть інтенсивність флуоресценції контрольної проби від інтенсивності флуоресценції для зразка, що аналізується.
Використовувані реагенти повинні бути аналітичної якості.
Використовувана вода - це дистильована вода або вода принаймні еквівалентної чистоти.
3.1. Метафосфорна кислота.
3.2. Кристалізується оцтова кислота.
3.3. Сірчана кислота 0,15 М.
3.4. Вугілля.
Зважте 200 г активованого вугілля (Норіт). Додайте літр соляної кислоти (r20 = 1,19), розведеної до десятої. Доведіть до кипіння, потім фільтруйте через спечене скло (пористість 4) при зниженому тиску. Поверніть активоване вугілля у велику склянку, додайте літр води, перемішайте і знову процідіть через спечене скло. Повторіть промивання і знову процідіть. Висушіть активоване вугілля в духовці протягом ночі при 110-120 ° C.
3.5. Екстракційні розчини.
3.5.1. Метафосфорна кислота - розчин оцтової кислоти.
У склянці при перемішуванні та невеликому нагріванні розчиніть 30 грам метафосфорної кислоти (HPO3) n у 80 мл оцтової кислоти, що кристалізується, та 400 мл води. Залиште охолоджуватися, а потім перенесіть кількісно в однолітрову мірну колбу і залийте водою (цей розчин можна витримати тиждень у холодильнику).
3.5.2. Метафосфорна кислота - оцтова кислота - розчин сірчаної кислоти.
Виконайте дії, як у 3.5.1, але замініть воду 0,15 М розчином сірчаної кислоти (3.3).
3.6. Розчин ортофенілендіаміну.
Зважте 20 мг ортофенілендіаміну, 2HC1. Розбавити водою до 100 мл (готувати негайно).
3.7. Розчин ацетату натрію.
Розчинити 500 мг ацетату натрію (CH3COONa, 3H20) у воді і довести до одного літра.
3.8. Комплексний розчин борної кислоти та ацетату натрію.
Розчиніть 3 г борної кислоти в 100 мл розчину ацетату натрію (3.7) (готувати негайно).
3.9. Основний стандартний розчин L-аскорбінової кислоти (100 мг/100 мл).
Зважте рівно приблизно 50 мг дегідратованої раніше L-аскорбінової кислоти в ексикаторі, захищеному від світла. Кількісно перенесіть у мірну колбу об’ємом 50 мл за допомогою екстракційного розчину (3.5.1) і доведіть до 50 мл (проводити безпосередньо перед використанням).
3.10. Розчин тимолового синього 0,04 р. 100 (м/м).
Розчиніть 0,1 г індикатора в 10,75 мл 0,02 М соди шляхом розтирання в агатовому розчині і розбавте 250 мл води (змініть зону рН = 1,2 червоної - рН = 2,8 жовтої).
Звичайне лабораторне обладнання, зокрема:
4.1. Змішувач - подрібнювач.
4.2. Мішалка для пробірки.
5. Порядок дій.
5.1. Попередній тест для оцінки кількості основних речовин у зразку.
Для рідких зразків розбавляють подвійним об'ємом розчину (3.5.1). Для твердих зразків розпилюють кількість зразка, що відповідає досліджуваній порції, і додають 25 мл розчину (3.5.1). Виконайте тест із кольоровим індикатором (3.10) на пластині свердловини. Якщо рН х 1,2, помітна наявність основних речовин у зразку і потрібно використовувати розчин (3.5.2), а не розчин (3.5.1) як екстракційний розчин.
5.2. Підготовка тестових зразків.
5.2.1. Корпус твердих зразків.
Подрібніть зразок і зважте кількість М грамів, що містить від 1 до 8 мг вітаміну С. Додайте 30 мл екстракційного розчину (3.5.1) або (3.5.2) залежно від результату випробування 5.1 і розтирайте протягом двох-трьох хвилин . Центрифуга. Зберіть супернатант і помістіть його в мірну колбу на 100 мл. Повторіть цю операцію екстракції двічі. Доливають до 100 мл. Повторіть цю операцію екстракції двічі. Розчином (3.5.1) доливають до 100 мл. Перенесіть отриманий розчин у конічну колбу об’ємом 250 мл. Додайте 2 г деревного вугілля (3.4), енергійно струсіть. Фільтр. Видаліть перші п’ять мілілітрів, потім зберіть фільтрат.
5.2.2. Корпус рідких зразків.
Візьміть пробу М грам або V мл, що містять від 1 до 8 мг вітаміну С. Якщо проба містить помітну кількість лужних речовин, відрегулюйте до рН 1,2 екстракційним розчином (3.5.2). Доливають екстракційним розчином (3.5.1) до 100 мл. Перенесіть отриманий розчин у конічну колбу об’ємом 250 мл. Додайте 2 г деревного вугілля (3.4), енергійно струсіть. Фільтр. Видаліть перші п’ять мілілітрів, потім зберіть фільтрат.
5.3. Підготовка стандартів.
Візьміть рівно 2, 4, 6 і 8 мл основного стандартного розчину (3.9) і помістіть їх у мірні колби об'ємом 100 мл. Доповнити екстракційним розчином (3.5.1). Перенесіть стандартні розчини в конічні колби об'ємом 250 мл. Додайте по 2 г деревного вугілля (3.4) у кожну конічну колбу, енергійно струсіть. Фільтр. Видаліть перші п’ять мілілітрів, потім зберіть різні фільтрати.
5.4. Флуорометричне визначення.
У 100-мл мірну колбу, що містить 5 мл розчину ацетату натрію (3.7), ввести 5 мл фільтрату, отриманого в 5.2.1 або 5.2.2, і довести водою до позначки.
5.4.2. Контрольний зразок.
У 100-мл мірну колбу, що містить 5 мл розчину комплексоутворювача борна кислота-ацетат натрію (3.8), вводять 5 мл фільтрату, отриманого в 5.2.1 або 5.2.2. Залиште на контакті п’ятнадцять хвилин, а потім відрегулюйте воду до позначки.
Дійте, як у 5.4.1, використовуючи 5 мл різних фільтратів (5.3).
5.4.4. Контроль жеребців.
Дійте, як у 5.4.2, використовуючи 5 мл різних фільтратів (5.3).
У серію пробірок помістіть 2 мл різних розчинів, отриманих у 5.4.1, 5.4.2, 5.4.3 та 5.4.4 (зробіть три вимірювання для кожного розчину). Захищаючись від світла, додайте до кожної пробірки 5 мл розчину ортофенілендіаміну (3.6). Добре перемішайте за допомогою шейкера для пробірок. Дайте реакції розвиватися протягом тридцяти п’яти хвилин у темряві. Потім проведіть вимірювання за допомогою спектрофлуориметра (оптимальна довжина хвиль збудження та випромінювання може залежати від використовуваного пристрою і повинна бути визначена заздалегідь).
5.4.6. Калібрувальна крива.
Розмістіть на абсцисі концентрації вітаміну С (виражені в мг/100 мл) стандартних розчинів, а на ординаті відповідні середні значення інтенсивності флуоресценції (кожне значення отримують відніманням від інтенсивності флуоресценції стандартного розчину стандартного контрольного розчину тієї ж концентрації).
Отримання калібрувальної лінії, якщо концентрація вітаміну С не перевищує 8 мг/100 мл.
6. Вираження результатів.
6.1. Метод розрахунку та формули.
Нанесіть на ординату виправлене середнє значення інтенсивності флуоресценції розчину зразка. Значення, прочитане на абсцисі (х), представляє кількість вітаміну С у 100 мл фільтрату, отриманого в 5.2.1 або 5.2.2.
Вміст вітаміну С у зразку визначається наступними співвідношеннями:
рідкий або твердий зразок (мг/100 г): (х/М) 100
рідкий зразок (мг/100 мл): (х/об) 100
Різниця між результатами двох визначень, проведених одночасно або послідовно одним і тим же аналітиком, не повинна перевищувати 1 мг/100 г (або 100 мл), коли вміст вітаміну С в аналізованій пробі становить від 10 до 100 мг/100 г (або 100 мл).