Дослідження антиоксидантної ефективності поліфенольних інгредієнтів яблучного соку в
Дослідження щодо антиоксидантної ефективності складових поліфенольних яблучних соків у клітинах товстої кишки людини Дисертація, затверджена кафедрою хімії Технічного університету в Кайзерслаутерні на присудження наукового ступеня доктора природничих наук (D386), представлена випускником хімічного відділу харчових продуктів Сандрою Шефер Кайзерслаутерн, 2006
Ця робота була створена в період з червня 2002 р. По листопад 2005 р. На хімічному факультеті, харчовій хімії та токсикології довкілля Технічного університету Кайзерслаутерна. День наукової дискусії: 25 квітня 2006 р. Голова екзаменаційної комісії: проф. Х. Сіцманн 1-й доповідач: проф. Г. Айзенбранд 2-й доповідач: проф. Д-р Лікар. Д. Шренк Дякую проф. Г. Айзенбранд та д-р. К. Янзовському за надання теми та за пропозиції та доброзичливу підтримку протягом докторського періоду.
Зміст 5.5.2.1 Додавання аскорбінової кислоти. 152 5.5.7.1 Залежність та оборотність рН. 154 5.5.8 РЕЗЮМЕ СТАБІЛЬНОСТІ ПЛІФЕНЛІВ 157 6 ДИСКУСИН І ПЕРСПЕКТИВИ. 158 7 РЕЗЮМЕ. 168 8 СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ. 170 9 ДОДАТОК. I 9.1. ІЛЮСТРАЦІЇ НЕ ПОКАЗАНІ. I 9.2 CV. V 9.3 ПРЕДСТАВЛЕННЯ ТА ПУБЛІКАЦІЇ PSTER. VI
Список скорочень ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF Логарифм концентрації іонів водню Логарифм Постійна дисоціації кислоти протеїнкіназа А протеїнкіназа С первинні (людські) клітини товстої кишки флоретин флоридин кверцетин кверцетин-о-семіхінон кверцетинхінон відновлені суміші яблучного соку (вичавки) екстракти реактивні форми кисню, англ. для активних форм кисню час зворотної фази утримання часу рутину стандартне відхилення для стандартного відхилення стандартна похибка для стандартної помилки натрієво залежний транспортер глюкози супероксиддисмутаза сульфорозамін В сульфосаліцилова кислота одноланцюговий розрив, англ. для одноланцюгового розриву фенолсульфат трансферази загальна антиоксидантна здатність тіобарбітурова кислота реакційноздатні речовини Тролок еквівалентна антиоксидантна здатність трихлороцтова кислота триетаноламін загальний глутатіон Інтенсивність хвоста, англ. для інтенсивності хвоста 5-тіо-2-нітробензоат загальний пероксильний радикал потенціал уловлювання трис (гідроксиметил) аміноетан UDP глюкуроніл трансфераза урацил дифосфат Асоціація німецької індустрії фруктових соків e.v.
Теоретичні основи можна запобігти за допомогою відповідної дієти та способу життя [Donaldson, 2004]. Молекулярні механізми канцерогенезу товстої кишки Канцерогенез - це багатоетапний процес, що включає молекулярні та клітинні зміни. Процес можна розділити на три взаємозв’язані стадії: ініціювання пухлини, просування, прогресування (рис. 3.3). I N I T I A T I N P R M T I N нормальна клітинна мутація генів, що регулюють ріст: APC, K-ras та ін., Ініційована селекція клітин зростання ініційованих клітин, абераційна мутація вогнищ крипт, делеція DCC, p53 викликає ендогенний FAP, генотокс HNPCC. Заміст Віруси RS Медіатори запалення Пошкодження тканин, CU, MC Adenoma P R G R E S S I N Selection Carcinoma Invasion Metastases Рисунок 3.3: Багатоступеневий процес розвитку раку товстої кишки, модифікований за [Schulte-Hermann et al., 2004]; Скорочення: APC: аденоматозна поліпозна паличка; FAP: сімейний аденоматозний поліпозний синдром; HNPCC: синдром неполіпозного колоректального раку; МС: виразковий коліт; MC: хвороба Крона; DCC: видалено при раку товстої кишки 9
Теоретичні принципи При великому споживанні білка відбувається збільшення передачі білків, пептидів та сечовини в товсту кишку. Бактеріальний метаболізм, крім усього іншого, утворює катіон амонію (NH + 4). Це є цитотоксичним в експериментах на тваринах і може відігравати певну роль у канцерогенезі. [Бесальський, 1999] 12
Теоретичні основи NADP + NADPH FAD червоний FAD окис перекисного окислення ліпідів хінон семіхінон радикальний окисно-відновний циклічний фермент інактивація H реакція Габера-Вейса 2 пошкодження ДНК Fe реакція Фентона Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH Рисунок 3.4: Приклади розвитку різних RS, захисних механізмів та пошкоджень (зелений: детоксикація, червоний: прямі наслідки реакцій RS; модифікований за [Kelly et al., 1998, Sies, 1985]; CAT: каталаза, GSH: знижений глутатіон, GSSG: окислений глутатіон, GPx: глутатіонпероксидаза, GSR: глутатіонредуктаза, SD: супероксиддисмутаза, CYP: цитохром P450-залежні монооксигенази. Halliwell and Gutteridge, 1999]. Н може виникати у багатьох біологічно значущих системах, наприклад, в результаті реакції Хабер-Вейса, каталізованої іонами важких металів (наприклад, з міддю або залізом, - рівняння 3.7), з 2 і H2 2. Часткова реакція, що каталізується на іони заліза, також відома як реакція Фентона (рів. 3.6) [Айзенбранд і Мецлер, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3,5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3,6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3,7) 14
Теоретичні основи 3.3. Окислювальний стрес та його наслідки 3.3.1 Перекисне окислення ліпідів (ЛП) Важлива роль ліпідів у клітинних компонентах підкреслює важливість можливого їх пошкодження окисленням у біологічних системах. Ця реакція окислення, також відома як ланцюгова реакція LP, розділена на три фази: ініціювання, розповсюдження, припинення і схематично показана на малюнку 3.5. LH R RH Ініціація LH L 2 LH Подовження ланцюга L X Кінцевий стабільний виріб Рисунок 3.5: Огляд LP, згідно [Kelly et al., 1998]; ЛГ: жирна кислота; R: реактивні види; Х: молекула, з якою реагує L. Ланцюгову реакцію починають реакційноздатні види, які можуть абстрагувати атом водню з метиленової групи (ініціація). Н починають ланцюгові реакції з усіма жирними кислотами, тоді як 2 реагують лише з деякими, особливо активованими, жирними кислотами [Halliwell and Gutteridge, 1999]. Це створює алкільні та пероксильні радикали, які потім реагують з іншими жирними кислотами. Радикальна ланцюгова реакція розгалужується через розкладання пероксидів, з яких виникає по два радикали (розповсюдження). Розрив ланцюга відбувається внаслідок реакції радикалів з молекулами, що утворюють стабільні продукти (термінація). [Belitz et al., 2001, Kelly et al., 1998] 17
Теоретичні основи Ідеальними субстратами для LP є поліненасичені жирні кислоти з бісаліловими метиленовими групами. У цих положеннях вуглецево-водневі зв’язки мають низьку енергію дисоціації, завдяки чому абстракція водню в результаті радикальних реакцій легко можлива. [Kelly et al., 1998] Перекисне окислення ліпідів та фрагментація, пов’язана з цим, призводять до появи різноманітних насичених та ненасичених молекул, наприклад Алкани, альдегіди, кетони та фурани [Belitz et al., 2001]. Окрім властивостей ароматичних компонентів, ці реакційноздатні молекули можуть також мати цитотоксичну, генотоксичну та мутагенну дію [Marnett, 1999]. Утворення малонового диальдегіду (MDA) слід пояснити як приклад продукту LP: R 2, 2 RH CCH 3 розширення ланцюга CCH 3 циклізація CCH 3 2, RH R CCH 3 H тепло, H + CCH 3 фрагментація малонового діальдегіду + H CCH 3 Рисунок 3.6: Утворення малонового диальдегіду (MDA) з α-ліноленової кислоти, згідно [Belitz et al., 2001] MDA утворюється з поліненасичених жирних кислот в результаті реакції з пероксильним радикалом, киснем, подальшої циклізації та фрагментації (рис. 18)
Теоретичні принципи NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-гідроксигуанін 2-гідроксиаденин 8-ксіаденін HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH тимінгліколь 5- (гідроксиметил) урацил 2,6-діаміно-4-гідрокси- 5-формамідопіридин Рисунок 3.7: Приклади окислених піримідинів та пуринів, згідно [Meneghini, 1997]. Напад D може призвести до різноманітних продуктів, напр. Окислення гуаніну в положенні 4, 5 або 8 (8-ксо-дезоксигуанін або 8-гідроксидезоксигуанін, 8-H-dG) пуринового кільця, що призводить до продуктів, що відкриваються кільцями, таких як 2,6-діаміно-4-гідрокси-5-формамідопіримідин ( FaPy) продовжують реагувати (рис. 3.8). Атака на піримідини також може призвести до димерів основи. [Halliwell and Gutteridge, 1999, Jaruga and Dizdaroglu, 1996, Kelly et al., 1998] HN NH 2 NNNR дезоксигуанінового окислення H відновлення NH 2 HN NNNR кільце, що відкриває NH 2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R Відкриття кільця NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH FaPy 8-H-dG Рисунок 3.8: Модифікації дезоксигуаніну радикалами H, згідно [Halliwell and Gutteridge, 1999] 20
Теоретичні основи відновлення ДНК Системи відновлення ДНК розпізнають модифіковані та невідповідні основи ДНК. Такі модифікації є переважно окисленими основами [Christmann et al., 2003]. Розпізнаючи і вирізавши пошкоджену основу ДНК-глікозилазою, створюються так звані сайти апурину/апіримідину (АП) і запускається ремонтний каскад відновлення основи (BER), найважливіша система відновлення окисних пошкоджень ДНК ( Малюнок 3.11). ДНК-глікозилаза AP-ліаза ДНК-глікозилаза AP-ліаза APE1 APE1 Pol δ/ε Polβ Polβ Fen-1/PCNA Polβ Lig1 Lig3 Рисунок 3.11: схематичне зображення BER, згідно [Scharer, 2003]; зелений: короткий патч - шлях, фіолетовий довгий шлях; Скорочення в тексті. ЕП-ендонуклеаза-1 (APE1) гідролізує фосфатний зв’язок на 5-ій стороні абазисних ділянок. Полімераза β (Polβ) вставляє нуклеотид послідовно в ділянку глухого отвору, а потім видаляє вушко внаслідок активності ліази AP. ДНК-лігаза III (Lig3) закриває нік і таким чином відновлює вихідну послідовність ДНК. Якщо BER викликаний біфункціональними ДНК-глікозилазами/APLyases 25
Теоретичне положення [Manach et al., 2004]. Крім того, можливі також гілки та зв'язки з нефлавоноїдами. Проантоціанідини сприяють гіркому і терпкому смаку рослинної їжі [Jorgensen et al., 2004]. У яблучних яблуках ступінь полімеризації переважно становить від чотирьох до одинадцяти одиниць флаванолу [Manach et al., 2004]. 3.4.1.2 Похідні флоретину Флоретин та його глікозиди (переважно флоретин-2 -глюкозид = флоридзин та флоретин-2-оксилоглюкозид) належать до дигідрохалконів, їх структура показана на малюнку 3.13. H H H R R = H: флоретин R = глюкоза: флоридзин Рисунок 3.13: Будова флоретину та флоридзину Вони зустрічаються в природі майже виключно в яблуках, а також у листі та корі яблуні. Іншим пунктом походження флоретину є мікробний розпад апігеніну в товстій кишці (глава 3.4.4). 3.4.1.3 Похідні гідроксикоричної кислоти Однією з найпоширеніших гідроксикислотних кислот є кавова кислота, яка зазвичай міститься в природі етерифікованою хінною кислотою або глюкозою. 5-кофеоїлхінова кислота також відома під назвою хлорогенова кислота (рис. 3.14). 30-й
Теоретичні основи HHRR = H: кавова кислота R = хінова кислота (C5): хлорогенова кислота HH 4 5 2 3 1 6 HH хінова кислота CH Рисунок 3.14: Структури кавової кислоти та хлорогенової кислоти згідно [Belitz et al., 2001] Хлорогенова кислота в основному міститься в каві та яблуках, але також і в інших семечкових та кісточкових фруктах [Belitz et al., 2001, Iwai et al., 2004]. У міцній каві можна досягти рівня до 500-800 мг/л [lthof et al., 2003]. Люди, які п'ють каву, приймають до 100 мг хлорогенової кислоти на день, а кавомани, навпаки, 500-1000 мг/день [lthof et al., 2001]. 3.4.2 Всмоктування Оскільки фенольним сполукам приписуються біоактивні ефекти in vivo, всмоктування в тонкому кишечнику є обов'язковою умовою. Рисунок 3.15 ілюструє можливі шляхи поліфенолів з їжею в шлунково-кишковому тракті. Поліфеноли Полфеноли Тканина Тонка кишка Печінка Товста кишка Товста кишка Жовчі Екскременти нирок Сеча Рисунок 3.15: Можливі шляхи поліфенолів у людей, згідно [Scalbert and Williamson, 2000] Ступінь та механізм поглинання суперечливі (таблиця 3.3). 31
Теоретична основа Таблиця 3.3: Вибір досліджень in vivo та in vitro щодо поглинання похідних кверцетину Досліджувана речовина Поглинання метаболітів Література пацієнти з ілеостомією Кверцетин 1 глікозиди Цибуля рутин 24% 52% 17% [Hollman et al., 1995] Випробувані (плазма протягом 24 год) Глікозиди цибуля рутин глікозиди яблуко