Дослідження та звіти про конференції Державного агентства з охорони навколишнього середовища
Дослідження та звіти з конференцій Державного агентства з охорони навколишнього середовища том 49 Вплив пестицидів на нерест та личинки земноводних
Дослідження та доповіді з конференцій Том 49 Вплив пестицидів на нерест і личинок земноводних на прикладі гербіциду (ізопротурон) та інсектициду (циперметрин)
5.1.2 Параметри води 27 5.1.3 Спектр земноводних 27 5.2 Поглинання 14 мічених речовинами С 28 5.2.1 Поглинання при нересті 28 5.2.1.1 Ізопротурон 28 5.2.1.2 Циперметрин 28 5.2.2 Кінетика поглинання личинок 29 5.2.2.1 Ізопротурон 29 5.2.2.2 Циперметрин 29 5.2.3 Метаболіти ізопротурону 30 5.3 Токсичність 31 5.3.1 Швидкість вилуплення та тератогенність 31 5.3.1.1 Ізопротурон 31 5.3.1.2 α-циперметрин 31 5.3.2 Ураження личинок 31 5.3.2.1 Ізопротурон та комерційний продукт TOLKAN FLO 31 5.3.2.2 α-циперметрин 32 5.3.3 Чутливість певних фаз розвитку 32 5.3.3.1 Ізопротурон 32 5.3.3.2 α-циперметрин 33 5.4 Біотрансформація 34 5.4.1 Ізопротурон 34 5.4.1.1 Чистий активний інгредієнт 34 5.4.1.2 Комерційні продукти 35 5.4.1.2. 1 ТОЛКАН ФЛО 35 5.4.1.2.2 ФЕНІКАН 36 5.4.2 Циперметрин 37 5.4.2.1 Діючі речовини 37 5.4.2.1.1 Циперметрин 37 5.4.2.1.2 α-циперметрин 39 5.4.2.2 Комерційний продукт 40 5.4.2.2.1 FASTAC SC 40 6 Обговорення 41 6.1 Польові дослідження 41 6.2 Проковтування активних інгредієнтів пестицидів ffe 42 6.3 Токсичність 43 6.4 Біотрансформація 46 6.4.1 Ізопротурон 46 6.4.2 Циперметрин 49 6.5 Енергетичні міркування 51 6.6 Управління 52 7 Висновки 54 8 Література 56 Публікації I-IV 64 ЗМІСТ 3
3: Хімічна структура 8 стереоізомерів циперметрину. α-циперметрин є рацематом двох ізольованих цис-ізомерів. Більш високі норми внесення циперметрину (100 г/га) призвели, наприклад, до концентрації діючої речовини 100 мкг/л, яку вимірювали через 4 години після обприскування невеликих водойм глибиною води 2,5-10,0 см (CROSSLAND, 1982). Відразу після нанесення було виявлено 24 мг/л циперметрину в надзвичайно тонкій поверхневій плівці (0,05 мм); протягом тижня значення впали до 50 мкг/л. Протягом першої години після наземного застосування циперметрину у винограднику в сусідній канаві безпосередньо під поверхнею води було виявлено 0,2-1,7 мкг/л циперметрину (BENNETT et al., 1980). Жодних поведінкових відхилень та летальних наслідків у популяцій риб та земноводних, що вибувають на вільному вигулі, не спостерігалося. ВСТУП 11
Рис. 4: Можливий перший етап метаболізму циперметрину через розщеплення складного ефірного зв’язку. Також є вказівки на біотрансформацію циперметрину через кон’югацію з глутатіоном (фаза II) після попереднього окиснення цитохромом Р-450 залежними ферментами монооксигеназних груп фази I (DAVIES) та ін., 1994). Всюдисущий GST здатний каталізувати кон'югацію різноманітних електрофільних компонентів, включаючи гербіциди та інсектициди, до глутатіону (HAYES & WOLF, 1988; BUCCIARELLI et al., 1999; GLÄßGEN et al., 1999), демонструючи різноманітність Ізоензими проілюстровано. Більшість ізоферментів GST розчиняються в цитозолі (так званий). Зв’язаний з мембраною GST (mgst) можна виділити з тканини печінки різних ссавців (наприклад, щурів; DEJONG та ін., 1988), а також із печінки пазуристої жаби (SUN et al., 1998). Цитозольні ізоферменти поділяються щонайменше на шість різних класів через подібні амінокислотні послідовності та специфіку субстрату: α, µ, π, θ, ζ та σ (EATON & BAMMLER, 1999). Порівняно з GST ссавців, про земноводних відомо порівняно мало (BUCCIARELLI et al., 1999). Попередні дослідження були спрямовані на виділення та ідентифікацію різних ізоферментів GST у земноводних (DI ILIO et al., 1992; GRUNDY & STOREY, 1998). Зміна характеру GST у земноводних між стадією ембріона та дорослою людиною описана для Bufo bufo; певні ізоферменти, що належать до π-класу пізніших стадій розвитку (bbgst P2-2), виявилися більш ефективними проти токсичної дії реактивних метаболітів ксенобіотиків (BUCCIARELLI та ін., 1999). Тому в рамках представленої тут роботи слід досліджувати вплив впливу пестицидів на активність GST на різних стадіях розвитку земноводних. 3.4 Тестування організмів Тест FETAX (Аналіз зародкового жаба-зародка-тест Ксенопуса; DAWSON & BANTLE, 1987) в даний час використовується як стандартизований інструмент для дослідження великої кількості біологічних процесів.
4 Матеріал та методи 4.1 Матеріал 4.1.1 Обладнання Обладнання ВЕРХ з 996 діодним детектором решітки LiChrospher 100 RP-18 колона (250 х 4 мм; 5 мкм) охоронна колона (4 х 4 мм) Сферисорб ODS колонка (250 х 4,6 мм; 2, 5 мкм) ВЕРХ із сцинтиляційним лічильником [14 C] ітрієвого скла Spherisorb ODSII колонка (250 х 4,6 мм; 3 мкм) вимірювач провідності ph-метр ротор 70,1 лічильник сцинтиляції кисню лічильник LSC 1900 TR сцинтиляційний лічильник 1409 Sep-Pak екстракційні колони спектрофотометр Uvikon 922 ультрацентрифуга L-60 Фотометр PT-3 Фотометр Виробник Waters Merck Merck Sykam Shimadzu Berthold Merck WTW WTW Beckman WTW Packard Wallac Waters Kontron Beckman Macherey & Nagel Uvicon 4.1.2 Радіохімікати Хімічна назва Спеціальна діяльність Продажі 14C-IPU 3- (4-ізопропіл- [14 C] -феніл) - 3,965 МБк/мг Міжнародний ізотоп 1,1-диметилуреа Чистота> 97% Німеччина 14C- Циперметрин R-ціано-3-феноксибензил (1R) - 4,625 МБк/мг Міжнародний ізотоп цис-3 (2,2- дихлоровініл) -2,2- чистота> 95% Німеччина дим етил [14 С] циклопропан карбоксилат 18 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ
4.1.3 Хімічні речовини Хімічна назва Продажі α-циперметрин R-ціано-3-феноксибензил (1R) -цис-3 (2,2-дихлоровініл) - Флука 2,2-диметилциклопропанкарбоксилат Бредфордівський реагент Sigma Brij-35 поліоксиетилен лауриловий ефір Fluka CaCl 2 хлорид кальцію Merck CDNB 1-хлор-2,4-динітробензол Fluka CH 3 CN ацетонітрил Roth CH 3 OH метанол Roth циперметрин R-ціано-3-феноксибензил (1R) -цис-3 (2,2-дихлоровініл) - Fluka 2,2-диметилциклопропанкарбоксилат DCNB 2,4-дихлор-1-нітробензол Fluka Diflufenikan Fluka DTE Дітіоеритрит Sigma EDTA Етилендіамінтетраоцтова кислота Sigma FASTAC SC BASF FENIKAN Bayer Fluorodifen 4-Nitrophenyl-2,2-nitrofluor-metilphenylether Fluka Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta Gluta -1,1-диметилуреа Fluka морська сіль Aquarienhandel Na 2 HPO 4 Динатрію гідрофосфат Sigma NaH 2 PO 4 Натрію дигідрофосфат Sigma NaHCO 3 Натрію гідрокарбонат Merck NAP-10 Sephadex G-25 колонки Amersham-Pharmacia TOLKAN FLO Bayer 4.1.4 Буфер Натрію буфер розчину фосфату r, 0,1 М, рН 6,5 мікросомний буфер: фосфатний натрієвий буфер, 20 мм, pH 7,0 20% гліцерин 1,4 мм DTE 1 мм EDTA 20% гліцерин 1,4 мм DTE Цитозольний буфер: натрію фосфатний буфер, 20 мм, pH 7, 0 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ 19
В ході курсу вміст радіоактивної речовини в личинках знову значно зменшився, через 24 години впливу він досяг 59,12 ± 1,62 нг циперметрину/мг свіжої ваги, майже значень контролю (53,65 ± 3,31 нг циперметрину/мг свіжої ваги) і залишався постійним (рис. 10). У личинок R. arvalis спостерігалося швидке поглинання та подальша елімінація міченого 14 С циперметрину. На фазі елімінації було виміряно збільшення вмісту радіоактивно мічених сполук вуглецю в середовищі, яке повинно бути неперетвореним 14-міченим циперметрином та/або його метаболітами. 5.2.3 Метаболіти ізопротурону Порівнюючи час утримання 14-мічених метаболітів B. bombina та B. variegata, що містять С, та вихідних стандартів, у обох видів можна виявити кілька метаболітів IPU, таких як N-деметильований похідний MDM-IPU, похідні С-гідроксильованих 1-OH-IPU, 2-OH-IPU, 1-OH-MDM-IPU та 2-OH-MDM-IPU та олефіновий метаболіт ізопропеніл-IPU (рис. 11, опубл. I). Рис. 11: Схема метаболізму ізопротурону згідно HAAS (1997). Створені метаболіти були виявлені в дослідженні, представленому тут. 30 РЕЗУЛЬТАТИ
8) Для обробітку сільськогосподарських площ у центрах поширення чутливих видів земноводних потрібні більш екологічно чисті методи виробництва. На додаток до сприяння інтегрованому захисту рослин та використання технології зменшення заносів, рекомендується встановлення зарослих буферних смуг навколо водойми (мінімальна ширина 20 м). Порядок денний 2000 пропонує інструменти компенсаційних виплат у районах, що зазнають впливу екологічних обмежень. ВИСНОВКИ 55
Абревіатури 1-OH-IPU 1-Hydroxy-IPU 1-OH-MDM-IPU 1-Hydroxy-Monodesmethyl-IPU 2-OH-IPU 2-Hydroxy-IPU 2-OH-MDM-IPU 2-Hydroxy-Monodesmethyl-IPU B bombina Bombina bombina B. variegata Bombina variegata BCF фактор біоконцентрації BSA бичачий сироватковий альбумін, фракція V CDNB 1-хлор-2,4-динітробензол; Фотометричний субстрат CP цитозольний буфер CPA циклопропанкарбонова кислота DCNB 2,4-дихлор-1-нітробензол; Фотометричний субстрат DTE Dithioerytrithol FFH Фауна-Флора-Хабітат GSH Глутатіон GST Глутатіон S-Трансфераза ВЕРХ Рідинна хроматографія високого тиску IPU Isoproturon kat Katal, одиниця вимірювання активності ферменту KO/W Коефіцієнт розподілу октанол/вода MDM-IPU мономедиметил-IPal мг Мікросомний буфер NaP натрію фосфатний буфер PBA феноксибензойна кислота R. arvalis Rana arvalis так звана розчинна глутатіон S-трансфераза 62 СКОРОЧЕННЯ