Двовимірний протокол гель-електрофорезу (переклад на німецьку)
Огляд
Двовимірний гелевий електрофорез (2DGE) - це техніка, яка дозволяє роз’єднати тисячі біомолекул із суміші. Ця методика включає два різні методи розділення, поєднані між собою: ізоелектричне фокусування (ІЕФ) та електрофорез додецилсульфат натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE). Це фізично розділяє сполуки по двох осях гелю за їх ізоелектричними точками (електрохімічна властивість) та їх молекулярною вагою.
Процедура у цьому відео охоплює ключові поняття 2DGE та загальну процедуру характеристики складу складного білкового розчину. Три приклади цієї методики показані під заголовком додатків, включаючи виявлення біомаркерів для ініціювання та прогресування захворювання, контрольне лікування у пацієнтів та вивчення білків після посттрансляційної модифікації (PTM).
Двовимірний, або двовимірний, гелевий електрофорез - це техніка, яка за допомогою двох різних методів поділу може відокремити тисячі білків від однієї суміші. Один із методів, SDS-PAGE або електрофорез у додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі, не повністю відокремлює суміші складних речовин самостійно. Двовимірний гель-електрофорез поєднує SDS-PAGE за другим методом, ізоелектричним фокусуванням або IEF, який розділяється на ізоелектричні точки, дозволяючи розчин потенційно всіх білків у клітині лізувати. Це відео демонструє принципи 2D гель-електрофорезу, загальну процедуру та деякі біомедичні програми.
Двовимірний гель-електрофорез починається з IEF як першого виміру. Кожен білок має рН, що називається ізоелектричною точкою, або pI, де чистий заряд дорівнює нулю. Коли білок піддається впливу електричного поля, він рухається до електрода з протилежним зарядом. Цікаві зразки являють собою іммобілізовані градієнти рН або IPG, смужки, завантажені амфолітами, які поховали молекули з кислими та основними групами. Потім на смужку градієнта рН подають електричне поле, змушуючи білки мігрувати до досягнення рН, що вирівнює їх pI, де вони втрачають чистий заряд.
Перед запуском другого виміру вбудовані білки обробляють SDS, денатурируя їх і забезпечуючи рівномірний негативний заряд. Після завершення смужки IPG наносять на поліакриламідний гель. Прикладене електричне поле тягне білки до анода з більшими білками, які повільно рухаються через гель.
Після того, як білкова суміш була розділена відповідно до pI та молекулярної маси, карта протеому візуалізується з плямами та ідентифікують цікаві білки.
Тепер, коли ми обговорили принципи 2D гель-електрофорезу, давайте розглянемо типову лабораторну процедуру.
Перед проведенням експерименту білки повинні бути солюбілізовані в середовищах. Солюбілізація зразка здійснюється шляхом деагрегації білків з комбінацією хаотропних агентів для порушення взаємодії водневих зв’язків, неіонних миючих засобів, запобігання зміні заряду білків, відновників, розриву дисульфідних зв’язків та буферів. Для видалення рясних білків та інших молекул, що заважають, матеріал послідовно екстрагують центрифугуванням та збиранням з отриманої гранули; з подальшим лікуванням ендонуклеазою, ферментом, який використовується, щоб не споживати ДНК, яка заважала б експерименту.
Після розчинення білків готують смужки IPG, промиваючи їх розчином для очищення смужок і даючи їм висохнути догори дном. Потім кожній смужці присвоюється номер власника смужки. Після цього смужка завантажується повільним ковзаючим рухом від негативного до позитивного полюса клітинного екстракту. Для регідратації на електрод і під гелеві смужки кладуть вологий промокальний папір; Потім смужки IPG підшиваються до інструменту IEF. Подається сильний електричний струм, і білки починають мігрувати.
Після завершення першого вимірювання гель готовий до SDS-PAGE у розливному пристрої. Смужки IPG оброблятимуть, поміщаючи їх у буфер рівноваги, що містить SDS. Блок електрофорезу готують з додаванням буфера для електрофорезу. Оброблені смужки IPG збирають щипцями, поміщають на гелеві пластини і герметизують розчином агарози. Потім джерело напруги застосовує електричне поле, яке утримується до тих пір, поки білки, що найшвидше рухаються, не опиняться на 1 см над дном гелю.
Після завершення електрофорезу білки необхідно візуалізувати. Традиційно це роблять фарбуванням кумасі синім або нітратом срібла. Білки, що цікавлять, переносяться з гелю за допомогою Вестерн-блот-аналізу та аналізуються.
Другий підхід до ідентифікації передбачає видалення білків з гелю, перетравлення їх під час їх аналізу за допомогою мас-спектрометрії.
Тепер, коли ми розглянули один метод, давайте розглянемо деякі способи використання 2D гель-електрофорезу.
Одним із найпоширеніших застосувань цієї техніки є ідентифікація молекул, що беруть участь у ініціації та прогресуванні захворювання. Двовимірний гель-електрофорез у поєднанні з мас-спектрометрією розпізнає регуляцію вгору або вниз специфічних білків у хворих зонах порівняно зі здоровими.
Крім того, 2D-гель-електрофорез корисний після прогресу пацієнта у відповідь на потенційний терапевтичний препарат. Зразки можуть бути взяті у пацієнтів у різний час після лікування. Таким чином, 2D-гель-електрофорез в парі з Вестерн-блот або мас-спектрометричним аналізом може виявити білки, пов’язані з негативними реакціями, такими як запалення; або відсутність білків у загартованому стані.
Ще однією областю застосування для 2D гель-електрофорезу є вивчення структури та функції білка після посттрансляційної модифікації або PTM, додавання білків після їх трансляції з мРНК. PTM може виконувати різноманітні функції, включаючи передачу сигналів білка, регулювання експресії генів або спричинення окисного пошкодження. Двовимірний гелевий електрофорез чутливий до таких змін, як метилювання або ацетилювання, які можуть спричинити зміну pI та молекулярної маси.
Ви щойно переглянули відео JoVE про 2D-гель-електрофорез. Це відео описує принципи методики, типову експериментальну процедуру та деякі з її застосувань у біомедичній галузі.