Ферментативна олігомеризація харчових білків в місцях реакції високого тиску і
Ферментативна олігомеризація харчових білків під високим тиском: місця реакції та функціональні наслідки з вересня 2007 року по липень 2012 року на кафедрі хімії харчових продуктів.
Диспут: 25 квітня 2013 р. Рецензент: проф. вип. нац. Доктор-інж. хабіл. Томас Генле Проф. вип. нац. Харшадрай Равель
Зміст Зміст Перелік рисунків V Список таблиць VIII Список скорочень XI 1 Вступ та цілі 1 2 Теоретичні основи 3 2.1 Лізоцим. 3 2.1.1 Механізми дії лізоциму. 2.1.1 Можливе використання лізоциму. 7 2.1.3 Модифікація лізоциму. 8 2.1.3.1 Фібрили та амілоїдні структури HEWL. 9 2.1.3.2 Нові біологічні функції через зміну конформації. 2.1.4 Еволюційний розвиток та взаємозв’язок з α-лактальним альбуміном. 14 2.2 Ензимне зшивання. 15 2.2.1 Мікробна трансглутаміназа. 15 2.2.1.1 Реакції, що каталізуються ТГазою, та механізм реакцій. 17 2.2.1.2 Аналітичні аспекти. 19 2.2.1.3 Використання у харчовій промисловості. 19 2.3 Неферментативні зшивки. 21 2.3.1 Теплові зшивання. 21 2.3.2 Поперечне зшивання In-Vacuo з нульовою довжиною. 23 2.3.3 Можливе використання неферментативно пов'язаних білків. 23 2.4 Вплив високого гідростатичного тиску на білки. 24 2.4.1 Вплив високого тиску на лізоцим курячого білка. 26 2.4.2 Вплив високого тиску на мікробну трансглутаміназу. 27 3 Експериментальна частина 29 3.1 Хімічні речовини, матеріали, прилади та програмне забезпечення. 29 3.1.1 Хімічні речовини. 29 3.1.2 Пристрої та витратні матеріали. 31 3.1.3 Екзаменаційні матеріали. 33 3.1.4 Програмне забезпечення. 33 І.
Зміст 4.6.2 Ідентифікація утворених ізопептидів. 145 4.6.3 Порівняння неферментативного та ферментативного зшивання HEWL.146 4.6.4 Порівняння термічного зшивання HEWL у вакуумі з β-казеїном та перші дослідження на ізоляті білка сироватки. 149 4.7 Висновок досліджень щодо ферментативного та неферментативного зшивання різних білків. 152 5 Резюме 154 6 Бібліографія 157 Публікації 172 Подяки 173 Страхування 174 IV
Список скорочень LMW α-la β-lg Lys m/z Met min ML ML MMW MO MPa MS mtgase NRT PBS PCR pdb rel. PE RP-HPLC rpm SDS-PAGE TCA TEMED TGase ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL низько зшитий зразок лізоциму з 1000 37 C Арнаудов та де Фріз, 2005 р. 2.0; 57 C 4,0 ± 0,7> 5000 Wang et al. 2009a ph 2.0; 55 С
10 * 1000 * Frare та ін., 2004 р. 2.0; 65 С
10 *> 600 * Cao et al., 2004 рН 4,5; Кімнатна температура; червоний. HEWL, 90% етанол Goda et al., 2000 90% етанол, 10 мМ NaCl, 25 C *, оцінено за допомогою ТЕМ-зображень 2-5 1000-2000
2 Теоретичні основи. Крім того, Менендес (2006) зміг показати, що при нижчих температурах 20 С і 600 МПа час, необхідний для 50% інактивації, збільшується приблизно до 100 хв (у шість разів). Крім того, фермент помітно пригнічується лише при кімнатній температурі від 400 МПа або при атмосферному тиску від 60 С. Виходячи з цих висновків, чутливість трансглутамінази до тиску зростає із збільшенням температури (20 С). Таким чином, на інактивацію мтгази впливає більше температура, ніж тиск, і відбувається за реакцією першого порядку (Lauber et al., 2001a). Повна дезактивація відбувається при атмосферному тиску через 2 хв та 80 С (Menéndez et al., 2006). Інактивація, спричинена тиском, базується на деградації α-спіралей у площі поверхні ферменту, що змінює третинну структуру, що, в свою чергу, впливає на зв'язування субстрату (Menéndez et al., 2006). На відміну від HEWL, повторне згортання після обробки високим тиском виглядає неповним, оскільки втрата активності зберігається при зниженні тиску. 28
75%, T3516 Sigma-Aldrich, Steinheim Thymol 3209.1 Carl Roth, Karlsruhe TPCK-оброблений трипсин від бика 10000 одиниць BAEE/мг Sigma-Aldrich, білок підшлункової залози Steinheim, аналітичний реагент T1426 трихлороцтова кислота (TCA) VWR, Дармштадт N-Трис (гідроксим) метилгліцин аналітичного класу Serva Elektrophoresis, Heidelberg (Tricin) тринатрію фосфат додекагідрат чистий, VEB Laborchemie, Apolda Tris (гідроксиметил) -амінометан (TRIS), буфер, A1379 AppliChem, Дармштадт
3 Експериментальна частина 3.1.3 Тестові матеріали Таблиця 3-4: Пептиди, білки та білкові суміші Назва Специфікація, номер каталогу. Виробник Lacprodan Alpha-10 (ізолят сироваткового білка) 45,1% α-лактальбумін 45,9% β-лактоглобулін ARLA Foods Ingredients amba, Viby, Данія Аспартилізин 94,30% синтез Dr. M. Hellwig, TU Dresden Glutamylglycine G1970 Bachem Lysozyme з курячого білка (HEWL)
70 000-96 500 Од/мг, 62971 Sigma-Aldrich, α-лактальбумін Steinheim
85% ізоляція від ізоляту сироваткового білка (глава 3.4) α-лактальбумін із бичачого молока> 85% Sigma-Aldrich, β-казеїн Штейнхайма до Ашаффенбурга (1963) Виділення доктором C. Парчефельд, ТУ Дрезден β-лактоглобулін з бичачого молока
90% (СТОРІНКА) Sigma-Aldrich, Steinheim Таблиця 3-5: Мікроорганізми з колекції штамів Allgemeine Biochemie, Technische Universität Dresden Назва Специфікація Забарвлення відповідно до Gram Origin Bacillus sphaericus - грам позитивного зразка ґрунту Degussa (Antwerp) Bacillus subtilis - грам позитивний Шюсхеймський університет coli TG 1 грам негативний невідомий Pseudomonas putida ATCC 17390 грам негативний Інститут мікробіології, Університет Хогенгейма Streptococcus lactis B 23/2/1 грам позитивний невідомий 3.1.4 Програмне забезпечення Таблиця 3-6: Використовуване програмне забезпечення Амінокислотний аналіз (ASA) Електрофорез (SDS-PAGE) Вимірювання флуоресценції (аналіз ThT, ANS) Пристосування кривої гель-проникаючої хроматографії (GPC), УФ-спектри (CD) Мас-спектроскопія (ESI-TOF-MS) Поверхнева гідрофобність (ANS) Програма Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, USA FL Solutions, Hitachi Спектри УФ/ВІС (конго-червоний) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, версія 2.05, Кнауер, Geräteechnik Berlin J-700 для Window s Стандартний аналіз, версія 1.35.01, JASCO Corp. та CDPro, метод CONTIN Автоматизоване отримання даних за допомогою ChemStation для LC 3D, Agilent Technologies, Böblingen Evaluation Data Explorer версії 4.0.0.1, Applied Biosystems, Фостер-Сіті, США Tecan i-control TM 33
3 Експериментальна частина Таблиця 3-9: Серії концентрацій для калібрувальних розчинів Концентрація L-глутамінова кислота-γ-гідроксамат [мм] Калібрувальний вихідний розчин [мкл] Трис-ацетатний буфер [мкл] Поглинання УФ λ = 525 нм 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 порожнє значення 0 1000 - Для розчину mtgase (40 U mtgase/100 мл) приблизно 50 mg mtgase в 10 ml 0,2 M Tris - Розчинений ацетатний буфер. Калібрування 1 мл калібрувального розчину змішували з 1 мл зупинного реагенту і вимірювали по відношенню до порожнього значення при довжині хвилі λ = 525 нм (рис. 3-2). Завжди проводилося подвійне визначення. Малюнок 3-2: Калібрувальна лінія: Залежність поглинання УФ при λ = 525 нм від концентрації L-глутамінової кислоти-γ-гідроксамату 40
3 Експериментальна частина Фотометричне визначення 50 мкл водного розчину зразка піпетували з 950 мкл NaOH в пробірку Еппендорфа і змішували з 500 мкл розчину Лоурі. Після 10 хвилин інкубації при кімнатній температурі додавали 500 мкл реагенту Фолін і розчини гомогенізували. Поглинання вимірювали через 2 години інкубації при 660 нм у спектрофотометрі Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech, Фрайбург). Калібрувальну лінію створювали в тих самих умовах з концентрацією від 20 до 600 мкг білка/мл (таблиця 3-10 та рисунок 3-3). Таблиця 3-10: Схема піпетування калібрування для визначення білка відповідно до концентрації HEWL Lowry [мкг/мл] Основний розчин HEWL [мкл] NaOH [мкл] Поглинання УФ λ = 660 нм порожнє значення - 1000 0 20 20 980 0,066 ± 0,003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 Зразок 50 * 950 - * 50 мкл розчину зразка відповідає розведенню 1:20 на основі досліджуваного об'єму Калібрування Рисунок 3 -3: калібрувальна лінія, залежність поглинання УФ при λ = 660 нм від концентрації HEWL [мкг/мл] 43
3 Експериментальна частина Таблиця 3-15: Програма розділення для визначення амінокислот, літієвої системи Час [хв] Буфер 1 Буфер 2 Буфер 3 Буфер 4 Температура колонки в печі [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Ідентифікація та кількісна оцінка ізопептидів Завод: Pharmacia LKB Alpha Plus Колона: Катіонообмінна хроматографічна колонка 190 х 4,6 мм PEEK із смолою 7 мкм з 11% зшиванням Буфер зразка: Цитрат натрію 0,2 N, ph 2,20 Об'єм ін'єкції: 20-100 мкл Елюенти: див. Таблицю 3-16 Потік: 20 мл/h Програма елюції: див. Таблицю 3-17 Виявлення: Постколонна дериватизація нінгідрином, температура спіралі 135 С, вимірювання: 570 нм Реагент нінгідрину: Сикам, Фюрстенфельдбрук Потік реагенту нінгідрину: 0,18 мл/хв. Оцінка: Chromstar 6.3 Таблиця 3-16: Використовувані буфери Натрієва система для визначення буферного складу Asp_Lys та Glu_Lys молярності рН зразка буфера цитрат натрію 0,2 2,20 1 цитрат натрію 0,2 3,16 2 цитрат натрію 0,2 4,03 3 цитрат натрію з хлоридом натрію 1,2 6,14 4 гідроксид натрію 0,4 48
3 Вимірювання параметрів експериментальної частини: Режим сканування: Режим даних: EX WL: EM Початок WL: EM Кінець WL: Швидкість сканування: Затримка: EX щілина: EM щілина: PMT Напруга: відгук: Флуоресценція випромінювання довжини хвилі 370 нм 400 нм 600 нм 240 нм/хв 0 с 5 нм 5 нм 700 В 0,01 с калібрування Рисунок 3-4: Вимірювання флуоресценції калібрування аналізу ANS з 1900 мкл розчину ANS (250 мкм) і зразком 100 мкл, λ ех = 370 нм та λ em = 480 нм, необроблений HEWL в порівнянні з HEWL після фібриляції протягом 96 год (за Wang et al., 2009b) при різних концентраціях, порожнє значення виправлено були доступні трохи більше гідрофобних сайтів зв'язування. Однак у присутності фібрильованого HEWL було виявлено значно сильніше, лінійне збільшення (рис. 3-4). 3.7.9.2 Аналіз червоного кольору Конго Цей тест на основі УФ/ВІС виявив збільшення поглинання розчину конго-червоного при 540 нм у присутності амілоїдних фібрил (Wang et al., 2009a). 58
3 Експериментальна частина 100 мкм основного розчину тіофлавіну Т готували з 1,6 мг тіофлавіну Т (ThT) у 50 мл буфера PBS. Потім основний розчин розбавляли 1:10 (об./Об.) Буфером PBS для отримання 10 мкМ розчину ThT. Процедура 80 мкл 0,05% розчину зразка міцності (об/об) змішували з 1920 мкл розчину ThT, гомогенізували і використовували безпосередньо для вимірювання флуоресценції. При довжині хвилі збудження 440 нм на спектрофотометрі флуоресценції F-4500 реєстрували спектр випромінювання від 450 до 530 нм. Для математичної оцінки використовували інтенсивність флуоресценції при 485 нм. Для визначення порожнього значення замість розчину зразка 80 мкл додавали сольовий розчин (рН 2,2, див. Параметри вимірювання: Режим сканування: Режим даних: EX WL: EM Початок WL: EM Кінець WL: Швидкість сканування: Затримка: EX щілина: EM щілина: PMT Напруга: відгук: Емісія випромінювання довжини хвилі Флуоресценція 440 нм 450 нм 530 нм 6 нм/хв 0 с 5 нм 5 нм 700 В 0,01 с калібрування Рисунок 3-6: Калібрування аналізу ThT за допомогою 1920 мкл розчину ThT (10 мкм) та зразка 80 мкл, λ ех = 440 нм та λ em = 485 нм, Неочищений HEWL порівняно з HEWL після фібриляції протягом 96 годин (за даними Wang et al., 2009b) при різних концентраціях, порожнє значення виправлено 60
4 Результати та обговорення зшивання, найкраще працювали 50-міліметрові буфери з тримерами в буфері Bis-Tris та слідами тетрамерів у системі Tris. Також можна було б подумати, що незначно підвищений перепад рН, який спостерігався в 50-міліметровому буфері Tris-HCl, був першим свідченням хорошого зшивання. Причиною зниження рН внаслідок зшивання був той факт, що деякі основні амінокислотні залишки перестали бути доступними для розчинників після утворення ізопептидного зв’язку. Обговорення залучених залишків лізину та глутаміну та їх середовища прослідковується у розділі 4.2.3. На основі результатів різних буферних систем для 50-мм трис-hcl-буфера можна було виявити найвищу зшивку HEWL з mtgase, тому було обрано це. Це означає, що значення рН від 7,2 до 9,0 загалом можна досягти за допомогою буферних систем на основі Тріс, оскільки згаданий буфер є стабільним у цих межах (Good et al., 1966). Крім того, вибране значення рН має відповідати запланованим експериментам. Лізоцим має ізоелектричну точку (pi)
37,5 хв) і метіоніну (Met, R t
43 хв) майже базові лінії були виявлені окремо. На даний момент у місцевому HEWL 78
4 Результати та обговорення Рисунок 4-10: RP-HPLC триптично перетравленого HEWL: A - необроблений HEWL; B - HEWL, оброблений мтгазою протягом 30 хв при 40 С і атмосферному тиску; C - HEWL з mtgase протягом 30 хв при 40 C та 600 МПа (LMW) Таблиця 4-8: Ідентифікація триптичних пептидів з природного HEWL методом RP-HPLC з ESI-TOF-MS Час піку [хв] м/z триптик [M + H] + [M + 2H] 2+ пептиди Теоретична пептидна маса 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605,36 4 13,0 874,5 437,7 15-21 873,41 5 13,5 776,4-117-123 775,35 6 14,5 1428,9 714,9 34-45 1427 .64 7 14.7 836.5-6-13 835.39 8 15.1 992.7 496 .8 6-14 991.49 9 16.5 1045.7 523.3 117-125 1044.53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268,7 634,9 22-33 1267,60 14 19,8 1805,1 902,6 97-112 1802,89 15 20,3 1676,4 838,5 98-112 1674,79 15 20,6 1676, 4838,5 98-112 1674,79 I 15,7 497,3 Невідомий артефакт II 17,75 1288,9 Невідомий артефакт Пептидні структури, виявлені на довжині хвилі 220 нм, не виявляли відмінностей для природного лізоциму (рис. 4-10 А) та HEWL з mtgase протягом 30 хв 40 C під атмосферним тиском або високим гідростатичним тиском (Малюнок 4-10 B і C). Це вказувало на те, що 81 використовували для лікування HEWL
4 Результати та обговорення A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84
4 Результати та обговорення D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z Рисунок 4-12: Мас-спектри шести ідентифікованих ізопептидних послідовностей (A - F) після триптичного перетравлення при різному часі утримування (див. Таблицю 4-9, оброблені мтгазою протягом 30 хв при 600 МПа і 40 або 60 С) та їх ізопептидні фрагменти (цифри відносяться до положень АА в послідовності HEWL) 85
4 Результати та обговорення близько половини необробленої HEWL. Зростаючий ступінь зшивання, таким чином, затримує зародження, з одного боку (плоский підйом), а з іншого боку, ріст фібрили (низьке максимальне значення). Дослідження потенціалу фібриляції підтверджують раніше висловлені очікування щодо другої теорії (Johnson et al., 2005 та Booth et al., 1997) щодо пригніченої тенденції до фібриляції. ABC Рисунок 4-33: Результати аналізів ANS, конго-червоного та ThT (A - C) з необробленим та зшитим HEWL (LMW - 2% HEWL, 40 U mtgase/g білка при 40 C, ступінь зшивання: 8,5% та HMW - 3% HEWL, 160 U mtgase/g білка при 60 C, ступінь зшивання: 65%) після інкубації при pH 2,2, 55 C протягом 96 годин злегка зшитий стан (НМГ) випадає в дрібний похмурий осад, тоді як необроблений HEWL утворює грубі агрегати (рис. 4-34). У розчині сильно зшитого HEWL (HMW) в будь-який момент часу не було видно опадів, незважаючи на дещо зростаючі сигнали; концентрація фібрили, необхідна для опадів, імовірно, не була досягнута. 119
11) може бути досягнуто після чотирьох циклів з вакуумом або без нього. 4.6.2 Ідентифікація утворених ізопептидів Після успішного теплового зшивання з використанням і без використання вакууму (ZLCL), питання про задіяні ізопептиди повинно бути роз'яснено. Як уже зазначалося, теоретично можуть виникнути два різні дипептиди (Simons et al., 2002). З лізину (Lys) і 145