Генетична діагностика - PDF скачати безкоштовно
Інструменти генетичної діагностики та аплікатини Паскаль Річард У. Ф. Кардігенетика та мігенетика
Передумови діагностики молочної залози Інструменти Клінічна стадія Визначення фенотипу Уважно вивчіть історію хворого Допитуйте його/її попередників Параклінічні обстеження Електрограма (ЕМГ) Візуалізація м’язів (МРТ) Кардіреспіраторна обробка Білгічні обстеження Біпія м’язів Білгічні константи Молекулярний аналіз
Аномалії ДНК саматичних клітин зародкових клітин Генетичні мутатини: хроматичні аномалії Мутатини хромового мікроорганізму: хромічна перегрупування На тих самих хроматичних мутатинах: мутатин однієї або декількох основ Між різними клітинами Виконавча генетика Карітип Цитгенетика
Генетичні захворювання Домінантна хвороба Рецесивна хвороба GENE MUTE Хвороба 1 Хвороба 2 Хвороба 3 Генетична хвороба Мультигенна хвороба 1 мутований ген u Gen A Gen C Gen E Gen B Gen D генетично гетерогенні Кілька мутованих генів і Gen K Gen L Gen M Gen J Gen P
Ген та його зміни Діагностичною корисністю є chisi у функції мутатинового типу Мутатини типу субститутинів EXONIC Помилковий сенс Nn sense ІНТРОНІКИ Немає ефекту: плімрфізми Вплив на сплайсинг Мутатини типу Insertins/deletins Невеликий розмір Зміщення рамки зчитування Без зміщення рамки зчитування Великий D, один або кілька exns Весь ген, описаний 100 000 мутатинів
Різні підходи Цілеспрямоване дослідження мутатину 1. Рецидивуючі мутатини (SMA, r повторний експансин; Mytnic dystrphy, OPMD) Для конкретних захворювань Cmplet-секвенування генів (-ів) 1. Exn за exn 2. З cdna Lng et cher Аналіз спеціалізований 1. Делетини/дублікати exns 2. FISH чисті великі делетини 3. ДНК злипання та фарбування Напр. FSHD Чисто специфічні гени Визначте мутатин (и) Аналіз зв’язку: чіпи SNP Залежить від структури сім’ї та відповідних діагнозів Дозволяє гени виключати Дозволяє знаходити нові гени Лімітатини Небезпека нових мутатинів
Білгічний матеріал ДНК Зразок крові, ротові клітини (ecuvilln) Амнітні клітини * Стандартне секвенування одного або декількох генів * МРНК Suthern Blt: М'язовий звуковий сигнал. шкіра (фібробласти) * Секвенування кдн одного або декількох генів * Аналіз сплайсингових послідовностей Діагностична процедура 1. Екстрактин нуклеїнових кислот (ДНК/РНК) 2. Ампліфікація генних послідовностей, що представляють інтерес Орієнтація на регіони Збільшення кількості ДНК з них регіни 3. Детектин аномалії 4. Ідентифікат аномалії
ДНК-аналіз Детектин аномалій: HRMA Провідні захворювання: гетерзиготні аномалії Дозволяє проводити аналіз багатьох пацієнтів одночасно Фрагментний/фрагментарний аналіз Добре підходить для виявлення приватних мутатинів при відомих захворюваннях Варіанти nn pathgens Interfere Не ідентифікуйте слабкий мутатин Швидко вирізати
Аналіз ДНК Ідентифікат аномалій: секвенування Підходить як для видатних, так і для рецесивних захворювань Негайно відмінне від аналізу мутатинів проти плімфізмів Фрагмент за фрагментом та геном за допомогою аналізу генів COL6A3 Нормальна послідовність c.6220g> t Пацієнт не виявляє рембінаїсів, що впливають на один або більше ген Переносить весь ген p.gly2074cys
Значення Ct Пошук основних змін Деякі патології зумовлені специфічними мутатинами, які не виявляються шляхом секвенування після ампліфікації: Втрата талію одного з двох алелів гена (recmbinaisn) Втрата 1 або більше exns на частковому дуплікатині алель алеля Кількісна ПЛР покладається на експлітатин кінетики ПЛР, що включає експенціальну, мделюється фазу A, плато, фазу QMPSF та MLPA Одночасне посилення кількох цільових послідовностей у кількісному cnditin Ct s 0 1 2 3 4 5 6 7 Номер LG cpy
Аналіз зв'язків SNPs чіпи Дозволяє вводити багато плимфрових варіатинів одночасно Різні чіпи (CHIPS) зі змінною кількістю SNP Збагачення в екс-SNPs Ассіатин вивчає число варіатинів Cpy
2,5 мільйона (фіксований) до 500 К (карма)
Технологічний прорив Наступне генеративне секвенування (NGS) Високопродуктивне секвенування великих кількостей послідовностей Aujurd hui Гени секвенуються індивідуально та послідовно, що залежить від клініки. Секвенування гена здійснюється шляхом ампліфікації кожного exn (500 bp) індивідуально Lng та нудний Nn вичерпний Дорогий у персоналах Незабаром усі гени індивіда зможуть секвенувати в 1 fis L exme (усі послідовності передачі) кількох пацієнтів можна секвенувати разом (60 Мб) Кілька цільових генів для багатьох пацієнтів можуть бути послідовно розміщеними в 1 фіс (20 Гб)
Високопродуктивне секвенування NGS: Наступне генеративне секвенування Одночасне секвенування великої кількості послідовностей: Ген Exme Genme 1Kb до 100Kb 1 до 100 exns (макс. 360 exns) 30 мегабаз (Mb) 180 000 exns 1% від генему 3500 Mb (3,5 млрд нуклеотидів пари) - гаплід від 27000 до 30000 генів Виберіть цікаві послідовності Посилюйте їх Послідовність їх
Exn 1a> c.210 Exn2 Exn 4 Exn 6 Exn 8 Exn 10 Exn 1b> 215 Exn 3 Exn 5 відсутній Exn 7 Exn 9 Exn 11 Exn 12 Exn 1a> c.210 Exn2 Exn 4 Exn 6 Exn 8 Exn 10 NGS Ампліфікатин мультиплекс генів, що представляють інтерес 300 250 200 150 100 50 0 LMNA Зразок Frward читає Зворотне читання Ttal
NGS Capture des sequences de genes dêret Chse prbes accrding t the gens you y t t capture Fragment yur your пациент (s) DNA (s) and Tag it (them) Змішайте prbes з пацієнтами dans і очистіть цільові послідовності Ампліфікуйте всі захоплені послідовності вдвох Послідовність усієї ампліфікованої ДНК
Biinfrmatique Nuvel корисна та нова професія для молочних генетиків Валідатин та сортування варіантів Застосовуйте критерії якості MQ: Показник якості вирівнювання (MQ> 20) QUAL: Варіант оцінки якості детектину (QUAL> 20) DP Використовується: Обгрунтованість варіанту детектину (DP> 30) GQ: якісний атрибут gentype (GQ> 20) Усунути цільові nn-регіони (нецільові) Інтергенні, Dwnstream та upstream, 5 UTR та 3 UTR Захоплені nn-гени (mirna,.) Intrns ? Відсортуйте інші варіанти за частотою алелів Видаліть SNV частоти 0,01 >> 0,99 Видаліть вище резерву Варіанти Hmzygte: Attentin Chrmsme X Синімічні варіанти: Attentine до криптичних місць сплайсингу Інтерпретуйте в кремнієвих шрамах
Приклади представлення результатів Пктуальний мутатин типу Хетерзигте CNV Мутатин типу Indel п. Ала1834
Варіанти хибного сенсу Як інтерпретувати патогенну роль Проблема полягає не в пошуку мутатинів, а в приписуванні їм патогенної ролі щодо захворювання Критерії патогенності варіанта 1. Модифікація амінокислоти (у кремнієвих аналізах) 3. Регін, який спостерігається при еволюції виду. 4. Сегрегатин, сімейний, якщо це можливо. 5. Відсутність у базах даних контрольованих клітин. Мутатин, який не змінює амінокислоту, не є плимфізмом. А cdn stp не є туюрсом сувентивні плімрфізми Ця інтерпретація неможлива 1. Помилковий пситичний: помилковий діагноз, помилкова генетична порада, помилкове лікування 2. Запобігає прогресуванню в діагностичному пошуковому рефлексі
Інструменти PGM: 10 МБ t 1 ГБ Life Science Illumina MySeq: 120 МБ 7,5 ГБ HiSeq: 600 ГБ HiSeq 2000 Rche 454 пірсеквенсинг платформ GS Junir: 35 МБ GS FLX: 720 МБ
Переваги та обмеження Отримані з послідовності численних генів одночасно Вичерпний аналіз генів, що беруть участь у більш повній та швидшій діагностиці. Вирізати розум, ніж аналіз генів до генів. Двофункціональний аналіз 1000/1500 євро на пацієнта), але відносний Nn адаптований до аналізу цільових мутатинів (пов'язаний,) Nn адаптований до екстреної діагностики (DPN) Важливий для крелера варіанти, визначені з клінікою, параклінічними обстеженнями
Cnclusin Першою важливою корисністю є визначення фентипу Cllabratin, розробленого між практиками додаткових дисциплін. Генетичний аналіз перебуває у повній технологічній розробці. Молекулярна діагностика вимагає певної діагностики та є важливою для генетичної консультації, лікування та можливої терапії