Імуногістохімічний та клітинний біологічний аналіз моноклональних антитіл людини проти колоректальної

З патологічного інституту Виконкому Вюрцбурзького університету: професор д-р мед. Х.К. Мюллер-Гермелінк Імуногістохімічний та клітинно-біологічний аналіз моноклональних антитіл людини проти колоректальної карциноми Інавгураційна дисертація на здобуття ступеня доктора медичного факультету Баварського університету Юлія Максиміліана у Вюрцбурзі, представлена Джудіт Лоренц з Фульди Вюрцбург, червень 2004

Доповідач: професор д-р вип. нац. Лікар. мед. H.P. Співреферент Фолмера: професор д-р мед. Х.К. Мюллер-Гермелінк Декан: професор доктор мед. С. Сільбернагль День усного іспиту: 21 січня 2005 р. Докторант - лікар

мої батьки, Ульріх та Крістіан

Зміст 1 Вступ 1 1.1 Колоректальна карцинома 1 1.2 Моноклональні антитіла 6 1.3 Мета роботи 11 2 Матеріал та методи 12 2.1 Матеріал 12 2.1.1 Буфери, розчини та середовища 12 2.1.2 Хімічні речовини та антитіла 13 2.1.3 Моноклональні антитіла людини 14 2.1 .4 Клітинні лінії 15 2.1.5 Витратні матеріали та лабораторне обладнання 15 2.1.6 Програмне та апаратне забезпечення 16 2.2 Методи імуногістохімії 17 2.2.1 Приготування заморожених зрізів 17 2.2.2 Градієнт Фіколла та підготовка цитоспінів 17 2.2.3 Імунопероксидазне фарбування кріосекцій та цитоспінів 18 2.3 Методи клітинної біології 20 2.3.1 Культура клітин 20 2.3.2 Тест на проліферацію (аналіз МТТ) 20 2.3.3 Виявлення клітинної смерті ELISA PLUS (Рош, Мангейм) 21

3 Результати 23 3.1 Фарбування імунопероксидазою 23 3.1.1 Колоректальна карцинома 24 3.1.2 Нормальна тканина 28 3.1.3 Тканина плода 34 3.1.4 Пухлинна тканина 35 3.2 Тест на проліферацію (аналіз МТТ) 39 3.3 Виявлення клітинної смерті ІФА PLUS (Рош, Мангейм) 42 4 Обговорення 45 5 Короткий зміст 58 6 Бібліографія 59 7 Список скорочень 75 Подяки CV

Вступ 11 1.3 Мета дипломної роботи У цій дисертації розроблено три моноклональні антитіла людини, які були розроблені в групі проф. H.P. Фолмерса в Патологічному інституті Вюрцбурзького університету за допомогою технології гібридоми (описано у: Vollmers et al., 1989) були виділені від пацієнта з раком прямої кишки, обстежені щодо перехресної реактивності зі здоровою та злоякісною дегенеративною тканиною. З цією метою проводили фарбування імунопероксидазою на заморожених зрізах різних нормальних тканин і тканин плода та на численних типах пухлин. Крім того, вплив антитіл на поведінку росту різних клітинних ліній карциноми товстої кишки характеризується in vitro за допомогою двох функціональних клітинних біологічних тестів (тест MTT, Cell Death ELISA PLUS). Дані, отримані в рамках даної роботи, повинні надати початкову інформацію про придатність антитіл як терапевтичних засобів для злоякісних пухлин товстої кишки і, таким чином, можливо, стати основою для подальших дослідницьких підходів.

Матеріал та методи 12 2 Матеріал та методи 2.1 Матеріал 2.1.1 Буфери, розчини та середовища PBS: 8 г NaCl 0,2 г KCl 1,15 г Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 г KH 2 PO 4 1 l А. бідист. Трис/NaCl: Розчин 1: 4,5 л А. редист. 40,5 г розчину NaCl 2: 1 л А. переробити. Доведіть 6 г трис (гідроксиметил) амінометану до рН 7,6 за допомогою палючої HCl, розчин 1 і 500 мл розчину 2 доводьте до рН 7,4 BSA/PBS: 5 мг BSA (бичачий альбумін, фракція V; Roth, Karlsruhe)/мл реагенту PBS DAB: 5 мл водопровідної води 1 таблетка DAB, 1 таблетка перекису водню (5 мл таблетки Sigma Fast 3,3'-Diaminobenzidine; Sigma, Steinheim) МТТ-реагент: 3- (4,5-диметилтіазол-2- іл) -2,5-дифенілтетразолію бромід (Sigma, Steinheim) 5 мг/мл PBS Сухе знежирене молоко: із магазину здорової їжі, 3 або 5% у PBS

Матеріал і методи 13 Трипановий синій: 0,5% трипановий синій (Sigma, Steinheim) 0,9% NaCl Кроляча сироватка: Linaris, Wertheim-Bettingen Сироватка людини: з кафедри трансфузійної медицини Університету Вюрцбурга RPMI 1640: базове середовище (500 мл) (лабораторії PAA, Лінц/Австрія) 1% глутаміну (5 мл) 1% пеніциліну/стрептоміцину (5 мл) 10% FCS (фетальна теляча сироватка) (50 мл) перед підігрівом до 37 С Трипсин/ЕДТА: Лабораторії ПАА, Лінц/Австрія 2.1. 2 Хімічні речовини та антитіла Хімічні речовини та антитіла були отримані від таких компаній: Ацетонова клітина виявлення смерті ELISA PLUS DMSO (диметилсульфоксид) Fico Lite H Сепараційне середовище Гліцерин желатин Haemalaun Tissue-Tek Mallinckrodt Baker, Девентер/Нідерланди Рош, Мангейм Мерк, Дармштадтен Лінаріс Merck, Дармштадт Merck, Мюнхен Sakura Finetek, Zoeterwoude/Нідерландський антицитокератин (CAM 5.2) Реагент Becton Dickinson, Бельгія

Матеріал та методи 15 2.1.4 Клітинні лінії Експерименти проводились на встановлених лініях HT-29, CACO-2, COLO 206F та COLO 320. За винятком COLO 320, усі вони демонструють прихильне зростання в культурі. Вирощування проводилось у середовищі RPMI 1640/1% глутаміну/1% пеніциліну/стрептоміцину/10% FCS при 37 C та 7% CO 2. 2.1.5 Витратні матеріали та лабораторне обладнання Витратні матеріали постачали наступні компанії: Піпетки Combitips Кришки скляних лічильних камер Нойбауера Слайди, наконечники для піпеток, реакційні посудини та пластикові контейнери, S-моноветти та канюлі, пластини та пляшки для культури клітин, картки цитофільтру, Еппендорф, Гамбург, Асоціація лабораторних спеціалістів Хартенштейн, Вюрцбург Менцель; Лангенбрінк, Еммендінген Грейнер, Фрікенхаузен; Гартенштейн, Вюрцбург Грейнер, Фрікенхаузен; Hartenstein, Würzburg Sarstedt, Nümbrecht Greiner, Frickenhausen Hartenstein, Würzburg Пристрої, що використовуються для роботи, надходять від таких компаній: Aquabidest system Milli-Q Plus PF incubators ELISA читачі Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, Munich

Матеріал та методи 16 Морозильна камера (-70 C) Кріостат 2800 Frigocut N Холодильник та морозильна камера Магнітна мішалка IKAMAG RTC мікроскоп DMLB фазовий контрастний мікроскоп DMIL ph-метр ph 525 піпетки піпетки допоміжний прилад стерильний стенд Lamin Air Vortex-Genie баланс водяна ванна Minitherm 2 центрифуга Мініфуга T цитоспін центрифуга 2 Герей, Ханау Райхерт-Юнг, Нуслох Келле, Фюрт Янке і Кункель, Штауфен Лейка, Ветцлар Лейка, Ветцлар WTW, Вайльхайм i. Мер Еппендорф, Гамбургський бренд, Вертхайм/Головний Герей, Ханау Бендер і Гобейн, Цюріх/Швейцарія Сарторіус, Геттінген Дінкельберг-Лабораторія, Ной-Ульм Герей, Ханау Шандон, Великобританія 2.1.6 Програмне та апаратне забезпечення Для графічного представлення результатів Використовуються програми EXCEL та POWERPOINT (Microsoft, США). Фотозаписи зрізів тканини були зроблені за допомогою цифрової камери Nikon Coolpix 990 (Nikon, Японія) та мікроскопа DMLB (Leica, Wetzlar) зі збільшенням у 100, 200 та 400 разів, а роздруківка зроблена на фотопапері (Hewlett Packard, США) кольоровим принтером тієї ж марки.

Результати 25 Результати фарбування HH 98/81-33-154 та HH 99/71-81-149 були ідентичними, і якщо ці два антитіла реагували позитивно, фарбування HH 101/99-14 також було позитивним . Це стосувалось загалом 7 карцином. На фіг. 1-4 показаний приклад позитивного фарбування HH 98/81-33-154 та HH 99/71-81-149, а також більш слабку та сильну реакцію HH 101/99-14 на тканину колоректальної пухлини. Для порівняння, негативні реакції всіх трьох антитіл з неопухолевою тканиною товстої кишки показані на рис. 5. a b c Рис. 1: Збільшення товстої кишки аденокарциноми: у 100 разів a: позитивний контроль (CAM 5.2) b: негативний контроль (L11/64-28) c: позитивна реакція з антитілом HH 98/81-33-154

Результати 26 abc Рис. 2: Збільшення товстої кишки аденокарциноми: 10x a: Позитивний контроль (CAM 5.2) b: Негативний контроль (RPMI 1640) c: Позитивна реакція з антитілом HH 99/71-81-149 abc Рис. 3: Збільшення товстої кишки аденокарциноми: 10-кратний a: позитивний контроль (CAM 5.2) b: негативний контроль (L11/64-28)) c: слабо позитивна реакція з антитілом HH 101/99-14

Результати 27 a b c d Рис. 4: Аденокарцинома сліпої кишки, що містить кільцеві клітини з печаткою. Збільшення: 200 разів a: фарбування ВІН b: позитивний контроль (CAM 5.2) c: негативний контроль (RPMI 1640) d: сильно позитивна реакція з антитілом HH 101/99-14

Результати 28 abcd Рис. 5: збільшення товстої кишки нормальної тканини: 200 разів a: негативний контроль (L11/64-28) b, c, d: негативні реакції антитіл HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 та HH 101/99-14 з неопухолевими залозами товстої кишки 3.1.2 Нормальна тканина Оскільки асоційовані з пухлиною антигени, розпізнані антитілами, можуть бути молекулами, які також експресуються здоровими клітинами, необхідно виявити можливі перехресні реакції Розкрити антитіла з важливими органами, щоб мати змогу зробити початкові висновки про сумісність антитіл у подальшому терапевтичному застосуванні.

Результати 30 No органу HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14 знайдено. + + + Товста кишка 3 0 3 0 3 0 3 Пряма кишка 3 0 3 0 3 0 3 Підшлункова залоза 2 0 2 0 2 0 2 Печінка 3 не може бути оцінена Селезінка 3 не може бути оцінена Тимус 3 0 3 0 3 0 3 тонзила 3 0 3 0 3 0 3 лімфатичні вузли 3 0 3 0 3 0 3 наднирники 3 0 3 0 3 0 3 нирка 3 0 3 0 3 0 3 сечовий міхур 3 0 3 0 3 0 3 протока протоки 3 0 3 0 3 0 3 простата 3 0 3 0 3 0 3 яєчка 3 0 3 0 3 0 3 молочна залоза 3 0 3 0 3 0 3 яєчник 3 0 3 0 3 0 3 туба матка 3 0 3 0 3 0 3 маточне тіло 2 0 2 0 2 0 2 шийка матки, порційна ваг. 2 0 2 0 2 0 2 шкіра 3 0 3 0 3 0 3 скелетний м’яз 3 0 3 0 3 0 3 плацента 1 0 1 0 1 0 1 спинний мозок 3 0 3 0 3 3 0 кора головного мозку 3 0 3 0 3 1 2 мозочок 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Гіпофіз 3 0 3 0 3 3 0 Кістковий мозок 2 0 2 0 2 0 2 Кров 2 0 2 0 2 0 2