Індукований макрофагами лектин типу С лежить в основі індукованого фіброзу жирової тканини

лежить

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Тканина жировий Вираз чудово при ожирінні
  • Модифікація розподіл ліпідів у мишей Мінкл КО
  • Покращений обмін глюкози у мишей Мінкл КО
  • Знижений фіброз жирової тканини у мишей Мінкл КО
  • Зменшення утворення CLS у жировій тканині мишей Мінкл КО
  • Експресія фіброгенних генів, стимульованих Мінкле в макрофагах
  • Стимульоване збільшення міофібробластів у металургійному комбінаті в FCS
  • Стимульований трентилом інтерстиціальний фіброз у жировій тканині
  • Обговорення
  • Методи
  • Реагенти
  • Тварини
  • Гістологічний аналіз
  • Гібридизація в якщо ти
  • Проточний цитометричний аналіз
  • Конфокальний мікроскопічний аналіз
  • Вміст колагену в жировій тканині
  • Вміст тригліцеридів у печінці
  • Тести на толерантність до глюкози та інсуліну
  • Вестерн-блот Akt
  • Аналіз сироватки
  • КТ-стимуляція
  • Кількісна ПЛР в режимі реального часу
  • Аналіз мікрочипів ДНК
  • Експерименти з БМТ
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Приєднання
  • Омнібусна експресія генів
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • Моноцити та макрофаги
  • Ожиріння
  • Патогенез

Анотація

вступ

Як місце перехресних зв’язків між адипоцитами та макрофагами, в ожиріній жировій тканині існує унікальна структура, яка називається коронковою структурою (CLS), де макрофаги, як вважають, забирають залишкові краплі ліпідів із мертвих адипоцитів 9, 10. Гістологічно прозапальні макрофаги М1 агрегуються, утворюючи SLC у жировій жировій тканині людей та гризунів. На відміну від цього, макрофаги М2 розпорошені в інтерстиціальних просторах між адипоцитами 10. Слід зазначити, що кількість CLS позитивно корелює із системною резистентністю до інсуліну у пацієнтів із ожирінням 11, 12, що свідчить про патофізіологічну роль CLS у запаленні жирової тканини та системному енергетичному обміні. Однак недостатньо зрозуміло, як утворюється жирова тканина під час ожиріння і як вона бере участь у реконструкції жирової тканини.

Ми показуємо тут, що Мінкл, індукований під час розвитку ожиріння, локалізується в макрофагах, що складають CLS в жировій тканині. Цікаво, що миші Mincle KO захищені від утворення CLS, спричиненого ожирінням, та фіброзу жирової тканини, що супроводжується зменшенням ектопічного накопичення ліпідів та резистентності до інсуліну в печінці. Крім того, лікування трегалозою-6,6′-диміколатом (TDM), гліколіпідом клітинної стінки мікобактерій, відомим як ліганд Mincle 13, індукує утворення CLS та інтерстиціальний фіброз у жировій тканині у мишей. Тонка стимуляція також сприяє потужній експресії генів, пов'язаних з фіброзом, у макрофагах in vitro. Це дослідження наводить докази того, що Mincle відіграє роль у перехресних перешкодах між адипоцитами та макрофагами в CLS, що призводить до активації фіброгенної програми. Наші дані також свідчать про те, що антагонізм Мінкеля в макрофагах пропонує нову терапевтичну стратегію для запобігання або лікування індукованого ожирінням фіброзу жирової тканини і, отже, накопичення позаматкових ліпідів.

Результати

Жирова тканина Тонке вираження при ожирінні

( в ) Еволюція з часом експресії мРНК і Emr1 Mincle (F4/80) в епідидимальній жировій тканині мишей дикого типу, що годували HFD або SD протягом періоду до 50 тижнів. Значення середні ± тиждень. Дані аналізуються неспареним t-тестом; n = 5-11; † P †† P § P §§ P -, CD45 + CD11b - F4/80 - та CD45 + CD45 + CD11b + F4/80 +, виділені з SVF, мРНК, Emr1, Acta2 (αSMA). Значення середні ± тиждень; n = 4. ( e ) Відсоток клітин, що експресують Мінкл, у різних імунних клітинах FCS. Значення є середніми для чотирьох зразків.

Повнорозмірне зображення

Зміна розподілу ліпідів у мишей Mincle KO

( в ) Маса тіла та вага жиру та печінки мишей Mincle KO та диких мишей на 16 тижні. Значення середні ± тиждень. Дані аналізуються дисперсійним аналізом (ANOVA) з подальшим тестом Тукі - Крамера. ## P # P ## P ¶ P

( в ) Ілюстрація TDM-стимульованих експериментів із використанням SVF. FSV, приготовані з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob, стимулювались КТ до 3 днів. ( ) Вплив стимуляції КТ на експресію мРНК Mincle, Tnfa, генів, пов'язаних з фіброзом (Tgfb1, Pdgfb, Timp1) та Acta2. Значення середні ± тиждень. Дані аналізуються неспареним t-тестом; n = 4, ** P - CD31 - у FCS, багатий фібробластами, приготований з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob за допомогою системи магнітної сортування клітин (MACS). Клітини стимулювали КТ протягом 7 днів. ( d ) Вплив стимуляції КТ на експресію мРНК Acta2 та Col1a1 (колаген I). Значення середні ± тиждень. Дані аналізуються неспареним t-тестом; n = 4, ** P

На основі наших спостережень ми висуваємо гіпотезу про наступну роль Мінкла у запаленні жирової тканини при ожирінні (рис. 8). Під час розвитку ожиріння експресія Мінкеля в основному індукується TLR4 в інфільтрованих макрофагах, як повідомлялося раніше 18. Активуючись ендогенним лігандом, що виділяється з відмираючих адипоцитів, Mincle бере участь у агрегації макрофагів, утворюючи CLS, де існує стійка взаємодія між адипоцитами та макрофагами. Активація нарізки також індукує експресію генів, пов'язаних з фіброзом через Syk, що призводить до утворення міофібробластів, можливо, через міжклітинний зв'язок між макрофагами та фібробластами. Як результат, надмірна продукція ECM може обмежити гіпертрофію адипоцитів, спричинену ВЧР, що відіграє певну роль у накопиченні ліпідів у печінці та непереносимості глюкози.

Під час розвитку ожиріння експресія Мінкле індукується в інфільтрованих макрофагах і активується ендогенним лігандом, що виділяється з відмираючих адипоцитів. Мінкл бере участь в агрегації макрофагів з утворенням CLS, а активація Мінкле також індукує експресію генів, пов'язаних з фіброзом, що призводить до утворення міофібробластів. Як результат, надмірне вироблення ECM може обмежити гіпертрофію адипоцитів, спричинену ВЧР, що відіграє роль у накопиченні ліпідів у печінці та непереносимості глюкози.

Повнорозмірне зображення

Підводячи підсумок, у цьому дослідженні ми продемонстрували, що Mincle відіграє вирішальну роль у формуванні CLS, спричиненого HFD, та фіброзі жирової тканини, що може зменшити здатність зберігати ліпіди в жировій тканині та покращити накопичення позаматкових ліпідів. Наші дані також припускають, що Mincle у макрофагах може бути новою терапевтичною мішенню для запобігання або лікування запалення жирової тканини та метаболічних розладів, спричинених ожирінням.

Методи

Реагенти

Всі реагенти були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі) або Nacalai Tesque (Кіото, Японія), якщо не зазначено інше.

Тварини

Гістологічний аналіз

Гібридизація in situ

Гібридизацію in situ для мРНК Mincle проводили, як повідомлялося 42. Блоки тканини, вкладені в парафін, з жирової тканини епідидиму були розділені на 8 мкм. Зрізи фіксували 4% параформальдегідом протягом 15 хв, обробляли 8 мкг мл -1 протеїнази К протягом 30 хв при 37 ° C, повторно фіксували 4% параформальдегідом і потім ацетилировали 0,25% оцтовим ангідридом протягом 10 хв. Гібридизацію проводили зондами при концентраціях 300 нг мл −1 при 60 ° С протягом 16 год. Після гібридизації зрізи промивали 5 х сольовим розчином цитрату натрію (SSC) при 60 ° C протягом 20 хв, а потім 50% формамідом і 2 × SSC при 60 ° C протягом 20 хв з наступною обробкою 50 мкг мл -1 RNaseA протягом 30 хв при 37 ° C. Після того, як зрізи додатково кілька разів промивали 2 × SSC та 0,2 × SSC, їх інкубували з кон’югатом анти-DIG AP (Roche) протягом 1 години при кімнатній температурі. Після двічі промивання реакції забарвлення проводили з розчином NBT/BCIP (Roche) протягом ночі. Кілька зрізів подвійно фарбували маркером макрофагів Iba1.

Проточний цитометричний аналіз

Проточний цитометричний аналіз SVF проводили, як описано 43, 44. Коротше кажучи, жирову тканину епідидиму збирали, розрізали на дрібні шматочки та інкубували протягом 20 хв у розчині колагенази (2 мг мл -1 колагенази типу 2 (Вортінгтон, Лейквуд, Нью-Джерсі)) з легким струшуванням. Після фільтрування через сітку 180 мкм ми центрифугували її та ресуспендували у солі, забуференному фосфатом (PBS). Ми двічі промивали дисоційований SVF PBS, інкубували їх протягом 10 хв в лізируючому еритроцитах буфері і фільтрували через сітку 70 мкм. Клітини сортували за допомогою FACSAriaII (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) і використовували для аналізу експресії мРНК. Клітини, що експресують мінкл, аналізували за допомогою FACSCantoII (BD Biosciences) та FlowJo 7.2.2. програмне забезпечення (Tomy Digital Biology, Токіо, Японія). Клітини, що експресують мінкл, ідентифікували за допомогою антитіл до Мінкле (клон 4A9; MBL, Нагоя, Японія), мічених Lightning-Link Atto-488 (Innova Biosciences, Кембридж, Великобританія). Інші антитіла, що використовуються в проточному цитометричному аналізі, були перелічені в додатковій таблиці 3.

Конфокальний мікроскопічний аналіз

Для конфокального мікроскопічного аналізу ізольовані шматочки тканини фіксували у 4% формальдегіді та просочували 0,5% Triton X-100. Потім зразки блокували 1% BSA та інкубували з парою первинних антитіл, а потім з відповідними вторинними антитілами. Фарбування досліджували за допомогою конфокальної мікроскопічної системи FluoView FV10i (Olympus, Токіо, Японія).

Вміст колагену в жировій тканині

Загальний вміст колагену в жировій тканині вимірювали за допомогою комерційного набору (аналіз загального колагену QuickZyme; QuickZyme Biosciences, Лейден, Нідерланди).

Вміст тригліцеридів у печінці

Загальні ліпіди в печінці екстрагували із застосуванням крижаного хлороформу та метанолу, 2: 1 (об./Об.). Вміст тригліцеридів у вмісті печінки вимірювали за допомогою набору для ферментативного аналізу (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія).

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Тест на толерантність до глюкози проводили після 18-годинного голодування. Концентрацію глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 і 120 хв після внутрішньочеревної ін'єкції глюкози (2 г кг-1 маси тіла) за допомогою глюкометра в крові (Glutest PRO R; Санва-Кагаку, Нагоя, Японія ). Для тесту на толерантність до інсуліну інсулін (0,5 од. Кг -1 маси тіла Humulin R-інсуліну; Eli Lilly, штат Індіанаполіс, Індонезія) вводили внутрішньочеревно після 1-годинного голодування. Концентрацію глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції.

Вестерн-блот Akt

Вестерн-блот проводили, як описано 45. Коротше кажучи, мишам, які страждали від їжі протягом 16 годин, ін’єктували інсулін (0,5 од. Кг -1 маси тіла Humulin R-інсуліну; Eli Lilly) або PBS через посткавальну вену. Печінку, м’яз підошви та епідидимальну жирову тканину видалили через 1, 2 та 3 хв після ін’єкції відповідно. Імуноблотинг проводили із застосуванням антифосфо-Akt (Thr308) антитіл (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) та анти-Akt антитіл (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія). Імуноблот-зображення кількісно визначали за допомогою ImageQuant LAS 4000 mini (Fujifilm, Токіо, Японія). Репрезентативні невирізані плями показані на додатковому рис. 10.

Аналіз сироватки

Концентрації FFA та ALT у сироватці крові та концентрації інсуліну вимірювали за допомогою стандартного ферментативного аналізу або комерційно доступного набору імуноферментних аналізів.

КТ-стимуляція

Для стимуляції перитонеальних макрофагів або SVF, спричинених тіогліколятом, з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob, TDM, розчинені в хлороформі в 1 мг мл -1, розбавляли в ізопропанолі і додавали на 12- або 48-лункові культуральні планшети (5 або 1,25 мкг TDM на лунку відповідно) з наступним випаровуванням розчинника, як описано 13, 46. У деяких експериментах перитонеальні макрофаги спільно культивували з фібробластами жирової тканини (CD45 - CD31 - клітини, приготовані з SVF мишей ob/ob за допомогою системи сортування магнітних клітин (MACS; Miltenyi Biotec, Auburn, CA)). Для експериментів in vivo емульсію, що містить TDM (10 мкг; посилання 13), вводили безпосередньо в жирову тканину епідидиму. Через три, п’ять та сім днів після ін’єкції жирову тканину епідидиму збирали і піддавали аналізу експресії генів та трихромних та імунофлуоресцентних фарбувань Массона.

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Кількісну ПЛР у реальному часі проводили, як описано 18. Коротше кажучи, загальну РНК екстрагували з тканин або культивованих клітин за допомогою реагенту Сепасол, а 10 нг кДНК використовували для ампліфікації ПЛР у реальному часі за протоколом виявлення SYBR GREEN у термоциклері (StepOne Plus, Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) . Праймери, використані в цьому дослідженні, перелічені в Додатковій таблиці 4. Дані були нормалізовані до рівнів 36B4 та проаналізовані за допомогою порівняльного методу КТ.

Аналіз мікрочипів ДНК

Аналіз мікрочипів проводили за допомогою масивів Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 згідно з інструкціями виробника. Нормалізацію даних про експресію генів обробляли за допомогою алгоритмів Affymetrix Microarray Analysis Suite 5.0 (MAS5). Диференційовано експресовані гени були відібрані із зміною кратності та значенням Р (зміна складки> 2, Р 39. Коротше кажучи, клітини кісткового мозку, отримані від мишей Mincle KO- Egfp Tg та мишей Egfp Tg, тричі промивали холодним PBS та вводили внутрішньовенно (1,8 × 10 6 клітин) на опромінених 8-тижневих мишей-реципієнтів дикого типу самців 7,5 Гр. Через 4 тижні швидкість заміщення клітин кісткового мозку визначали підрахунком EGFP-позитивних клітин у периферичній крові, а потім мишей годували HFD протягом 16 тижнів.