Клітинні ефекти, механізми дії та методи виявлення гормонів щитовидної залози та їх

Клітинні ефекти, механізми дії та методи виявлення гормонів щитовидної залози та їх метаболітів Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора rerum naturalium (доктор реф. Нац.) З біології, подана на факультет наук про життя Університету Гумбольдта в Берліні магістром трофологом Іною Легмфул, президентом Берлінський університет імені Гумбольдта проф. Ян Хендрік Ольберц Декан факультету наук про життя професор д-р Річард Луцій Рецензент: 1. Проф. Д-р. Вернер Клоас 2. Проф. Д-р. Йозеф Керле 3. Проф. Д-р. Йенс Міттаг День усного іспиту: 23 травня 2015 р

клітинні

Зміст Зміст. I Список скорочень. V Перелік рисунків. X Список таблиць. XI резюме. XII реферат. XIII 1. Вступ. 1 1.1 Щитовидна залоза. 1 1.2 Гормони щитовидної залози (ТГ). 1 1.2.1 Біосинтез. 1 1.2.2 Випуск і транспортування. 3 1.3 Вісь щитовидної залози гіпофаламусу гіпофіза (HPT). 4 1.4 Обмін гормонів щитовидної залози. 4 1.4.1 Метаболізм гормонів щитовидної залози дейодазами. 4 1.4.2 Альтернативний метаболізм TH. 6 1.4.3 Місцеві та системні ефекти активного TH T 3. 7 1.5 Важливі метаболіти TH 3.5 T. 9 2 1.5.1 Місцеві та системні ефекти 3,5 T 2. 9 1.5.2 Транспорт у сироватці крові та клітинах-мішенях . 10 1.5.3 Рецептори метаболітів TH. 10 1.5.4 Методи виявлення для 3,5 T 2. 11 1.6 Важливі метаболіти TH 3 T AM. 12 1 1.6.1 Місцеві та системні ефекти 3 T 1 AM. 12 1.6.2 Транспортування у сироватці та до клітини-мішені. 13 1.6.3 Рецептори метаболітів TH. 13 1.6.4 Методи виявлення метаболіту. 14 1.7 Важливі метаболіти TH TA 1 3 Тиреоцтова кислота. 14 2. Мета роботи. 17 2.1 Метод виявлення метаболітів гормонів щитовидної залози. 17 2.2 Вплив метаболітів гормонів щитовидної залози на модель культури клітин. 17 3. Матеріал. 18 3.1 Хімічні речовини. 18 3.2 Пристрої. 18 І.

3.3 Витратні матеріали. 18 3.3.1 Набори реагентів. 18 3.3.2 Буфери та розчини. 19 3.4 Бази даних. 20 3.5 Програмне забезпечення. 20 4. Методи. 23 4.1 Молекулярно-біологічні методи. 23 4.1.1 Виділення РНК за допомогою тризолу. 23 4.1.2 Синтез кДНК. 23 4.1.3 qpcr. 24 4.1.4 Грунтовки. 25 4.2 Біохімічні методи білка. 28 4.2.1 Принцип Бредфорда. 28 4.2.2 Впровадження Бредфорда. 28 4.3 Культура клітин. 29 4.3.1 Клітинна лінія MIN6 підшлункової залози миші. 29 4.3.2 Гепатоцелюлярна клітинна лінія людини HepG2. 29 4.4 Аналізи цитотоксичності/життєздатності клітин. 29 4.4.1 Аналіз MTT Аналіз залежності від НАДФН клітинної токсичності. 29 4.4.1 а) Принцип аналізу. 29 4.4.1 б) Впровадження. 30 4.4.2 Аналіз життєздатності клітин АТФ. 30 4.4.2 а) Принцип аналізу. 30 4.4.2 б) Впровадження. 30 4.5 Поглинання клітин/зв’язування поверхні клітини 3 T 1 AM. 30 4.6 Екстракція клітин MIN6 для LC MS/MS аналізу. 31 4.7 Екстракція супернатантів культури клітин MIN6 для LC MS/MS аналізу. 32 4.8 LC MS/MS параметри. 32 4.8.1 AbSciex 4000 аналіз клітинних лізатів культури клітин. 32 4.8.2 AbSciex 6500 аналіз супернатантів культури клітин. 34 4.9 Секреція інсуліну, стимульована глюкозою (GSIS). 36 4.10 Аналіз конкретного субстрату енергообігу за допомогою біоаналізатора Seahorse XF. 36 4.10.1 Принцип вимірювання. 36 4.10.1 а) Мітохондріальне дихання. 37 4.10.1 б) Гліколіз/метаболізм субстрату. 39 II

Список абревіатур C Градуси Цельсія µ мікро µg мікрограми µl мікролітр µm мікромоляр 2 DG 2 дезоксиглюкоза 3 T 1 AM 3 йодтиронамін AADC ароматичний L амінокислота декарбоксилаза Рис. Рис. Рис. AC аденілат циклаза Adra 2α адренергічний рецептор 2alpha ANO1 аномаїн Anoma Індекс маси BSA бичачий сироватковий альбумін cdna комплементарна ДНК CLIA Chemilumineszenez Імуноаналіз Ct цикл запаси COX Cytochrome C оксидаза DC Декарбоксилаза Дехал Дегалогеназа DEPC Діетилпірокарбонат Діо Дейодаза DIT 3,5 Diiodtyrosine DMEM DubelcDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDexDoxyDexDoxyDexDoxyDexDoxyDexDoxDexDexDex Подвійна оксидаза ECAR Швидкість позаклітинного підкислення V

EDC ELISA ERK EST FBS FCCP Етил 3 (3-диметиламінопропіл) карбодіїмід фермент-пов'язаний імунологічний аналіз позаклітинна регульована кіназа експресована мітка послідовності фетальна бичача сироватка карбоніл-ціанід p трифторметоксифенілгідразон ft 3/ft 4 вільний/не білок зв’язаний T 3/T 4 GPL GFR f f/t 4 GPL GFR f f/t 4 GPL FF g g FF g gf FF g GFR f f/T 4 GPL FF g g FR f f/T 4 GPL FF h H 2 OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT вісь HRP icv Ig i.p. Ipro i.v. kda KRBH Lat/LAT LCB LC MS/MS LDL m M mab швидкодіюча рідинна хроматографія вперед Прискорення проти мишачого IgG, Fc специфічного та біотинільованого G білка, рецептора, стимульованого глюкозою секреція інсуліну вода води перекис водню глікогемоглобін високоефективна рідинна хроматографія гіпоксантин гуанін фосфорус гіпофіза гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз гіпофіз внутрішньоочеревинний іпроніазид внутрішньовенно кілодальтон Кребса Рінгера HEPES буфер L-тип амінокислотний транспортер низькопоперечний буфер рідинна хроматографія у поєднанні тандемна мас-спектрометрія низька щільність ліпопротеїд мілімолярне моноклональне антитіло VI

MAPK Mct/MCT хв MIN6 З MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr Mitogen активована білоккинцетарна трансформаторна білка кіназа трансформатор лінія миші Осередки 3 monoiodo тирозин сіль тетразолия messengerrna нана не аналізував нікотинамід-аденін-динуклеотид нікотинамід-аденін-динуклеотид-фосфат натрію азиду не виявлено несуттєвих амінокислоти нанограми натрію йодид сімпортера нанометрового нмоль не кількісний не має істотне значення Na +, taurochlorygenate cotransporting поліпептид безводного протонирование кисневмісного фосфонати кисень phosphoniferous антитіло, що не тиреоїдні швидкості органічного транспортування фосфонати буфер над-thyroidalphospheinate нічного часу кислоти фосфонати фосфорного кисень phospholeptic антитіла над тиреоїдної швидкістю polycono-фосфорного антитілом за допомогою фосфорного кислого фосфонати окисленого фосфонати фосфатно-окисленої швидкості фосфонати протягом ночі Сольовий розчин Фосфатно-сольовий сольовий розчин з ланцюговою реакцією Твін-полімерази Фосфатидил-інозитол 3-кіназа післяопераційна фібриляція передсердь (серця) кількісна в реальному часі ПЛР VII

rev RIA RNA rpm rpm RQ rt 3 s.c. SD SDS sec SHIP Slc/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH зворотний радіоімунологічний аналіз Обертання рибонуклеїнової кислоти/хв зворотний коефіцієнт дихання зворотний 3,3,5 трийодний L тиронін підшкірний тиреоїд додецилсульфат натрію друге Дослідження здоров'я в Померанії розчинена речовина-носій сульфотрансфераза тиронін 3/3 тиронін 3,5/3,3/3,5 дійодин L тиронін 3,3,5 трийодин L тиронін 3,3,5,5 тетрайодин L тиронін/Тироксин тиреоцтова кислота трис ацетат EDTA буфер тиронамін мікробний амінорецептор асоційований рецептор тироксин зв'язуючий глобулін трикарбонова кислота тиреоглобулін тиронін, гормон щитовидної залози трет бутилметиловий ефір тиреопероксидаза тиреотропний гормон рецептор альфа тиреоїдний гормон рецептор 3/бета тиреоїд стимулюючий гормон тиреотропний гормон 3/бета тиротипін тиротропін тиротропін тиротропін тиротропін тиротропін тиротропін тиротропін тиротропін тиротипін тиротипін тиротипін тиротропін тиротипін тиротропін тиротип 4 Транстиретин VIII

Об'єм ЛПНЩ% ліпопротеїдів дуже низької щільності об.% IX

Механізм транспорту до клітини-мішені відомий, і активація планарних мембранних рецепторів ще не досліджена. 16

Таблиця 2 Загальновживані набори реагентів Набір реагентів Абсолютний qpcr SYBR Green Mix Біологічний аналіз білка Аналіз барвника Концентрат реагенту CellTiter Glo Люмінесцентний аналіз життєздатності клітин RQ1 РНКаза без ДНКази ІмуноПур Маб ізотипуючий набір Інсулін (миша) ультрачутливий ІФА Іскрип Select cdna Синтез Pierce MicroCross BCCA Набір для аналізу білків PIERCE EZ Link Plus Активована пероксидаза PIERCE SuperSignal ELISA Femto Максимальна чутливість Субстрат RIA rt 3 Сефароза r Білок Слайд A Касети для діалізу Lyzer 2K MWCO ThermoScript Зворотна транскриптаза Тризол Виробник Abgene (Epsom, Великобританія) Bio Rad Laboratgaga (Мюнхен) Штат Вісконсин, США) Promega (штат Медісон, штат Вісконсин, США) Pierce Chemical Co. (Рокфорд, штат Іллінойс, США) Діагностика ДРГ (Марбург) Bio Rad (Мюнхен) Candor Biosciences (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Thermo Scientific ( Waltham, MA, США) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) ZenTech SA (Бельгія) GE Healthcare (Фрайбург) Pierce Chemical Co. (Рокфорд, Іллінойс, США) Invitrogen (Карлсруе) Thermo Scientific (Уолтем, штат Массачусетс, США) 3.4 Бази даних У таблиці 4 наведені всі використовувані системи управління даними. 3.5 Програмне забезпечення У таблиці 5 узагальнено програмне забезпечення, що використовується у цій роботі. 20-го