Колекція регіонів мозку заморожених гризунів для протоколу подальшого аналізу (переклад на французьку)
Резюме
Ця процедура описує збір дискретних заморожених областей мозку для отримання високоякісного білка та РНК із використанням недорогих та загальнодоступних інструментів.
Анотація
У міру того, як наше розуміння нейробіології прогресувало, молекулярні аналізи часто проводяться на невеликих ділянках мозку, таких як медіальна префронтальна кора (MPFC) або накопичене ядро. Завдання в цій роботі полягає в розтині правильної ділянки, зберігаючи мікросередовище, яке слід дослідити. У цій статті ми описуємо простий і недорогий метод із використанням ресурсів, доступних у більшості лабораторій. Цей метод зберігає нуклеїнову кислоту та білки, зберігаючи тканину замороженою протягом усього процесу. Мозок розрізають на ділянки від 0,5 до 1,0 мм за допомогою мозкової матриці і поміщають на заморожену скляну пластинку. Орієнтири в кожному розділі порівнюються із посиланням, таким як Атлас головного мозку Аллена Миші, а регіони розтинають за допомогою холодного скальпеля або біопсійного пуншу. Потім тканина зберігається при -80 ° C до використання. За допомогою цього процесу mPFC щурів та мишей, ядро ядер, дорсальний і вентральний гіпокамп та інші регіони були успішно проаналізовані за допомогою qRT-PCR та західних аналізів. Цей метод обмежений ділянками мозку, які можна визначити за чіткими орієнтирами.
Вступ
Ця робота ілюструє розтин заморожених областей мозку для вилучення високоякісних білків кислоти або нуклеїнової кислоти, використовуючи посилання, такі як Атлас мозку мишей Аллена 1, як орієнтир. У цій техніці мозок заморожують і зберігають при -80oC для подальшого розрізу та розтину, зберігаючи його в замороженому стані. Цей процес дозволяє дослідникові зібрати велику кількість мозку за один сеанс і розібрати їх пізніше для точного збору з різних областей мозку.
Точний збір цікавих областей мозку (ROI) часто необхідний при відповіді на запитання, що стосуються експресії генів та білків. У той час як фармакологія, електрофізіологія та оптогенетика можуть застосовуватися на гризунах дикого типу або генетично сконструйованих, щоб допомогти з’ясувати молекулярні зміни, що лежать в основі спостережуваної поведінки 2, 3, 4, для вимірювання змін, спричинених транскриптомами та протеомами, часто використовуються для підтвердження цих результатів., Такі методи, як кількісна зворотна полімеразна ланцюгова реакція (RT-qPCR), вестерн-bloat, RNAseq 5, MAPSeq 6 та HPLC 7, є надійними та відносно низькими за вартістю, що дозволяє багатьом лабораторіям '' вивчати молекулярні зміни, викликані в невеликих регіонах мозок 2, 4, 5, 6 .
Розтин мікропунктів на заморожених тканинах не є новим. У ранніх роботах Міклоша Палковіця та інших детально описуються основні методи 14, 15. Ця презентація значною мірою відповідає початковій роботі, з деякими вдосконаленнями, що сприяють підвищенню ефективності та зменшенню витрат необхідного обладнання. Наприклад, мозкові розрізи робляться в замороженому блоці мозку, а не на кріостаті. Це дає більш товсті секції, що зменшує кількість секцій, необхідних для збору зразків рентабельності інвестицій. Цей метод також розтинає зразки на замороженій скляній пластині, яка лежить на сухому льоду в ізольованій коробці. Це створює крок під заморожування стенду для роботи. Розрізані таким чином ділянки легко маніпулювати, що дозволяє досліднику порівняти обидві сторони кожного розділу з посиланням на обмеження забруднення регіонів за межами бажаної рентабельності інвестицій.
Переваги цього протоколу полягають у тому, що 1) мозок утримується у замороженому стані протягом усього процесу, що сприяє збереженню білків та нуклеїнової кислоти і дає дослідникові час для ретельного збору штучних інтелекту; 2) необхідні реагенти недорогі і їх можна знайти в більшість лабораторій молекулярної біології. У цьому процесі цілий мозок розділяється на 0,5-1,0 мм в матриці мозку і поміщається на заморожену скляну пластинку, яка постійно охолоджується сухим льодом. Орієнтири, знайдені в Атласі мозку Аллена 1 або інших атласах мозку 16, 17, використовуються для виявлення цікавих областей, які потім розтинають за допомогою холодного удару або скальпеля. Оскільки тканини ніколи не розморожуються, регіони, зібрані таким чином, забезпечують високоякісні РНК та білок для подальшого аналізу.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
З тваринами, які використовувались у цьому дослідженні, поводились етично та гуманно, як повідомляється Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) при Університеті Індіани та Національними рекомендаціями. Інститути охорони здоров’я (NIH).
ПРИМІТКА: Перш ніж починати будь-які роботи, усі інструменти та поверхні слід промити відповідним розчинником для видалення нуклеаз 18.
1. Зберігання мозку
- Швидко видаліть мозок від евтаназованих дорослих мишей CD1 з диким папером вагою приблизно 30 г, використовуючи звичайний підхід 13, і заморозьте спалах на 60 секунд у рідкому азоті або ізопентані, попередньо охолодженому сухим льодом.
- Зберігайте заморожені мізки при -80 ° C в алюмінієвій фользі або конічних пробірках до використання.
2. Підготовка мозкового матриксу
- За двадцять чотири години до розсічення тканини помістіть чистий матрикс мозку (див таблиця матеріалів)на стосі розморожених пакетів морозильних камер. Заправте сторони матриці між двома упаковками морозильної камери, переконайтесь, що залишається приблизно 0,5 см між дном отворів для бритви і верхом наборів з гелем (рис.). Покладіть на торці алюмінієву фольгу, щоб полегшити охолодження.
ПРИМІТКА. Купуючи матрицю мозку, придбайте таку, що є достатньо великою, щоб охопити весь об’єм мозку, що підлягає розтину. - Помістіть коробку з мозковою матрицею та упаковками морозильної камери в морозильну камеру -20oC, прикривши верхню частину на ніч.
3. Розміщення замороженої скляної пластини
ПРИМІТКА: Мета цієї установки - підготувати замерзлу поверхню, на якій можна розсікати відділи мозку.
4. Розділи розтину
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Для підтвердження цього методу медіальну префронтальну кору відбирали у дорослих мишей-самців CD1, екстрагували та характеризували РНК та білок. РНК аналізували за допомогою капілярного електрофорезу. Деградована РНК демонструє втрату інтенсивності рибосомних смуг 28S та 18S, а також продукти деградації, такі як мазок між 25 і 200 нуклеотидами (Малюнок 5А, зразок 1). Високоякісна РНК демонструє чіткі рибосомні смуги з невеликим або відсутністю сигналу в області нижчої молекулярної маси (Малюнок 5А, зразок 2). У цьому аналізі також генеруються числа цілісності РНК (RIN). RRIN вище 7 вказують на високу якість 19 РНК. РНК, виділена із зразків методом замороженої дисекції, демонструвала сильну рибосомну смугу та високі значення RIN, що дуже сприятливо порівнюється з РНК, приготовленою зі свіжозібраних тканин (Рисунок 5B).
Однією з переваг цього методу є те, що велика кількість мозку може бути швидко зібрана та збережена протягом одного сеансу для ретельної дисекції пізніше. ROI також можна зберігати, не розморожуючи тканини. За допомогою цього методу дослідник може зібрати велику та різноманітну колекцію ІДР, з яких можна отримати високоякісну нуклеїнову кислоту або білки. Для підтвердження цього моменту РНК витягували з розсіченого MPFC, який зберігався кілька тижнів (зібраний мозок зберігався кілька місяців). Усі зразки продукували високоякісну РНК з чіткими рибосомними смугами та RIN більше 8 (рис. 5С).
Вестерн-блот-аналіз використовували для підтвердження цілісності білка розсіченого замороженого mPFC, як зазначено раніше 20. Західні плями демонструють знижений сигнал від високомолекулярних мішеней, коли білки розкладаються. Продукти деградації також виступають у вигляді мазка при менших молекулярних вагах у колонці. Для цього аналізу білок збирали, переносили в нітроцелюлозу та зондували антитілами проти високомолекулярної мішені KCC2 та білка з нижчою молекулярною масою - актину (рис. 5D). У всіх випадках смуги були чіткими та чіткими, без помітних продуктів для продувки для KCC2 або актину. Ці експерименти підтверджують, що дисекція рентабельності інвестицій за допомогою цього методу дозволяє екстрагувати високоякісні РНК та білки.
Рисунок 4: Розбиття рентабельності інвестицій. (AT) Секції маніпулюють щипцями, які періодично охолоджують на сухому льоду. Обидві сторони кожного розділу слід порівнювати з відповідними зображеннями атласу перед розтином. () ROI видаляються з відділів мозку холодним скальпелем або (VS) біопсійний пунш. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Ця робота описує методику виділення конкретних малих ділянок мозку, обмежуючи деградацію нуклеїнової кислоти та білків. Пошкодження мозкової тканини відбувається швидко після смерті організму. Частково це пов’язано з швидким накопиченням позаклітинного глутамату та обумовленою екситотоксичністю, яка виникає 21. RNA Messenger особливо вразливий до деградації 22, 23. Деградація білків та нуклеїнової кислоти різко знижується при низьких температурах, про що свідчить нещодавня стаття, що описує біологічну активність клітин мамонта, заморожених у вічній мерзлоті 28 000 років тому 24 .
За допомогою описаного тут методу мозок заморожують, а інструменти та тканини тримають нижче нуля, поки не розпочнеться екстракція нуклеїнової кислоти або білка. Потім заморожені ROI гомогенізують у буфері, що містить інгібітори протеази та нуклеази, захищаючи молекули-мішені від деградації при більш високих температурах.
У цьому процесі важливо визначити чіткі орієнтири для ідентифікації IDE у розділах. Для цього добре працюють волокнисті шляхи передньої комісури та мозолистого тіла, як і шлуночки. Також можуть бути використані зміни форми гіпокампу при русі вперед-назад. Залежно від того, як мозок вирівняний в матриці, орієнтири можуть бути упередженими або відсутніми. Слід бути обережними перед тим, як брати ІПП із таких секцій, оскільки в зразку можуть бути забруднені ділянки. Перед тим, як збирати, рентабельність інвестицій повинна бути перевірена з обох сторін розділу, щоб переконатися, що вона узгоджується протягом усього розділу. Розсічення рентабельності інвестицій обмежується чітко визначеними ділянками мозку, які перевищують приблизно 1 мм у розмірі x-y.
При розтині рентабельності інвестицій необхідно тримати тканини замороженими, не роблячи їх занадто крихкими. Занадто холодні тканини руйнуються при натисканні шилом або скальпелем. Регіон інтересу часто важко визначити з інших фрагментів, коли це відбувається. Одним із способів пом'якшити це є короткочасне переміщення секцій у теплу зону плити (подалі від сухого льоду). Також важливо підтримувати скляну пластину в чистоті. Після обробки ділянки наліт слід очистити лезом бритви, перш ніж переходити до наступного. З часом вода конденсується на пластині для дисекції повітря, що може покрити або іншим чином перешкодити розпізнаванню зразка. Очищення пластини проводиться шляхом вишкрібання гострого краю леза бритви на поверхні скла та витирання будь-якого гелю та зібраного сміття. Невеликі рентабельності інвестицій стають невідмінними від небажаних фрагментів мозку, тому підтримка чистоти робочої зони дуже важлива.
Багато лабораторій використовують комерційні продукти для захисту РНК у зібраних тканинах. Хоча лабораторні молекули добре зберігаються таким чином, мінусом є те, що морфологія тканини різко змінюється. Тому може бути важко знайти регіони, що цікавлять, за допомогою довідкових карт. Таким чином, розрізання ШІ із заморожених мізків перед використанням цих продуктів може бути кращим варіантом.
Хоча в цій роботі ми зосередились на корональних зрізах, цей метод повинен добре працювати як для горизонтальних, так і для сагітальних ділянок. Карти для цих орієнтацій, як правило, мають нижчу роздільну здатність порівняно з картами для корональних розрізів. Однак це швидко змінюється завдяки ініціативам таких груп, як Інститут мозку Аллена. Іншим фактором є вік тварини під час збору врожаю. Морфологія мозку молодих тварин сильно відрізняється від такої у дорослих і потребуватиме спеціалізованого атласу та матриці мозку різного розміру. Такі ресурси, як Атлас мозку мозку 26, що розвивається, необхідні для збору точних зразків мозку молодих мишей.
Ця робота описує процес, який можна використовувати для збирання невеликих ділянок всередині мозку гризунів. Морфологія зрізів добре зберігається за допомогою заморожених нарізок, а оскільки тканини зберігаються замороженими від збору врожаю до екстракції, якість нуклеїнової кислоти та білка висока. Цей процес має перевагу перед розтином свіжозібраної тканини, оскільки мозок зразків великої групи тварин можна швидко зібрати та зберегти. Потім регіони в мозку можна ідентифікувати за допомогою орієнтирів, визначених у загальних атласах мозку, та збирати їх з обережною швидкістю, не втрачаючи молекул-мішеней. Цей метод може бути хорошим варіантом для деяких лабораторій, оскільки необхідні інструменти та регенти недорогі та легко доступні.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.